Gıda Mühendisliği Bölümü GDM203 Genel Mikrobiyoloji Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü 2014/ 15 Güz Dönemi Ders notu 04a http://food.eng.ankara.edu.tr/index.php?p=622&l=1

Sayım 01 Çeşitli amaçlarla mikroorganizma sayımı gerekir. Var/ yok testleri farklıdır. -Mikroskobik sayımlar -Kültürel Sayımlar -Metabolizmaya Dayalı Sayımlar

Sayım 02 Var/ yok testlerinde sayı önemli değildir. Var ya da yok analizi yapılır  25g/mL gıdada Salmonella var/ yok. Sayım, çok genel olarak gıda mikrobiyolojisinde izin verilen mikroorganizma sayıları için uygulanır.

Mikroskobik Sayımlar 01 Ucuzdur, çabuktur. Canlı ve ölü hücre ayrılamaz (Maya sayımında ayrılır, DEFT) -Thoma lamı (hemastometri) -Petroff-Hauser Lamı -Breed Yöntemi -Çiğ sütte somatik hücre sayımı -Howard Lamı -DEFT Üretim izni olanlara var

Mikroskobik Sayımlar 02 Thoma Lamı: Şekilde görüldüğü gibi, küçük kare olarak belirtilen gerçekte bir kare prizmadır. Derinlik boyutu, şekilde verilen çukurun derinliğini göstermekte olup, 1/10= 0,1 mm’dir. 1 küçük kare olarak belirtilen kare prizmanın hacmi= 0,05 mmX0,05 mmX0,1 mm= 0,00025 mm3= 1/4.000 mm3'dür. Bir sayım alanında 16X25 = 400 küçük kare olduğuna göre toplam sayım hacmi= 0,00025 mm3X400= 0,1 mm3'dür.

Mikroskobik Sayımlar 03 Toplam 16 büyük karex25 küçük kare=400 küçük kare bulunur. Thoma lamında sayım sonucu AxSFx10.000 formülü ile hesaplanır. Burada A= 16 büyük karede sayılan maya adedi, SF ise seyreltme faktörüdür. 10.000 ise 0,1 mm3' deki sayım sonucunu 1 ml'deki sayıya dönüştürmek ve standart sonuç elde etmek için kullanılan bir değişmezdir (1 mL= 1 cc= 1 cm3= 10.000X0,1 mm3). Maya sayımında seyreltme (dilüsyon) % 10'luk asetik asit ile yapılır. Bu derişimdeki asetik asit maya hücrelerini birbirlerinden ayırarak kümeleşmeyi önlediği için, kolay bir sayım yapılmasına yardımcı olur.

Mikroskobik Sayımlar 04 Petroff-Hauser Lamı, Thoma lamından 5 kere incedir. Bu şekilde netlik derinliği daha duyarlı olup bakteri sayımında kullanılır.

Mikroskobik Sayımlar 05 Breed yönteminde 0,01 mL süt örneği 1 cm2 alana yayılır. Mikroskop görüş alanı bilinmelidir. Buradan mikroskop faktörü hesaplanır. 2500-5500 4000 Sayı: AxMFx100xseyreltme faktörü (adet/mL)

Mikroskobik Sayımlar 06 Somatik Hücre, çiğ sütün kalitesi hakkında bilgi verir. Yüksek sayılar istenmez. İnek meme hastalığı ya da yanlış sağım denetlenmesi içindir. Mikrobiyoloji ile ilgisi yoktur. Breed Yöntemi gibidir. Otomatik sayım cihazları vardır.

Mikroskobik Sayımlar 07 Howard lamı; domates, kayısı, şeftali vb. ürünlerde hammaddenin küf miktarı hakkında bilgi verir. Özel bir lam ve lameldir. 25 görüş sahası pozitif ya da negatif olarak değerlendirilir sonuç %pozitif küflü saha olarak verilir. Deneyim gerekir.

Mikroskobik Sayımlar 08 DEFT Direct Epifluoresan Filter Technique Direk Epifloresan Filtre Tekniği Filtre, Acridin Orange ile boyanır, Epifluresan mikroskopta incelenir. Canlı ve yeni ölmüş bakteriler portakal, önceden ölmüş olanlar yeşil görülür. Antikor ile işaretlenmiş boyalar da kullanılabilir.

Kültürel Sayım 01 -Yayma kültürel sayım -Dökme kültürel sayım -Damlatma yöntemi -EMS (En Muhtemel Sayı) -Membran Filtrasyon.

Kültürel Sayım 02 Canlı hücrelerin katı ya da sıvı besiyerinde (EMS) sayılmasıdır. Sadece canlı hücreler sayılır, uzun zaman alır, maliyeti mikroskobik sayımlarla kıyaslanamayacak kadar yüksektir. Beklenen/ hedeflenen sayıya göre yöntem seçilir. Yayma kültürel sayım; Dökme kültürel sayım; EMS; Membran filtrasyon sıralaması geçerlidir. Damlatma yöntemi geçerli bir sayım yöntemi değildir, titre belirleme amacı ile kullanılır.

Kültürel Sayım 03 Katı (agarlı) besiyerinde sayım, canlı hücrelerin koloni oluşturması ve bu kolonilerin sayılarak «her canlı hücre 1 koloni oluşturur» prensibi ile materyaldeki canlı hücre sayısının hesaplanması esasına dayanır. Bu amaçla sayım yapılacak materyalden belirli bir miktar alınır ve besiyerine aktarılır.

Kültürel Sayım 03 Koloni oluşması için gerekli inkübasyon süresinin sonunda Petri kutusundaki koloniler sayılarak materyaldeki canlı hücre sayısı hesaplanır. Ölü hücreler çoğalıp koloni meydana getiremeyeceği için bu yöntemde sadece canlı hücreler sayılır.

Kültürel Sayım 04

Kültürel Sayım 05 Temel sayım yöntemi yayma kültürel sayımdır. Petri kutusuna agarlı besiyeri önceden dökülür, 0,1 mL örnek aktarılır ve yayılır. Psirotrof: Soğuğa dayanıklı Termotrof/ Termodurik: Sıcağa dayanıklı Termostabil: Geniş sınırlar içinde gelişen Termolabil: Dar Sınırlar içinde gelişen

Kültürel Sayım 06 Temel sayım yöntemi yayma kültürel sayımdır. Petri kutusuna agarlı besiyeri önceden dökülür, 0,1 mL örnek aktarılır ve yayılır. Genel/ selektif besiyeri; aerob/ anaerob/ vb. inkübasyon atmosferi; sıcaklık; süre. Orijinal sıvı örnekte 1000 KOB/ mL ya da katı örnekte 10.000 KOB/ mL olan örnekler için uygundur. 30-300 KOB/ Petri kutusu kuralı!

Kültürel Sayım 07 Petri kutusuna 1 mL örnek aktarılır, üzerine 40-45 oC’ta tutulan besiyeri dökülür, karıştırılır. Besiyeri sıcaklığı kritiktir. Yüksek olursa hedef mikroorganizmaya zarar verir, düşük olursa dökme sırasında besiyeri jelleşir. Psikrofiller için uygun değildir. Orijinal sıvı örnekte 100 KOB/ mL ya da katı örnekte 1.000 KOB/ mL olan örnekler için uygundur. 3 Petri kutusuna 1 mL yayma ya da 14 cm çaplı Petri kutusu.

Kültürel Sayım 08 Damlatma yönteminde Petri kutusu, tabanından 6 ya da 8 eşit parçaya bölünür, karşılıklı her parçaya ardışık olarak 0,01 mL damlatılır. Besiyerinin bu damlaları emmesi beklenir, inkübasyon sonunda yaklaşık 2 cm2 alanda koloni sayılması güçtür ve sağlıksız sonuç verir. Titre belirlemesi için uygundur. Titre: Pozitif sonucun alındığı son seyrelti

Kültürel Sayım 09 Membran Filtrasyon Bir membran filtreden geçirilebilecek sıvı ya da gaz numunelerde çok az sayıdaki mikroorganizma sayısının belirlenmesi için uygundur. Bakteriyolojik analizlerde çok genel olarak 0,45 µm porlu filtreler kullanılır.

Kültürel Sayım 10 Filtre, uygun bir besiyerine yerleştirilir. Mikroorganizma olan yüzey üstte olmalıdır. Mikroorganizma gelişmesi (koloni oluşturması) sırasında besiyerini emerek koloni oluşturur.

Kültürel Sayım 11 EMS ve Metabolizmaya dayalı sayımlar için izlemeye devam edin. 04a 04