IUI OLGULARINDA SPERM KROMATİN KONDANSASYONU BOZUKLUKLARI VE ANTİOKSİDAN İLİŞKİSİ UTD Kongresi 2011 Antalya Prof.Dr.Tülay İrez

DNA Kalitesinin önemi Erkekte DNA kalitesi üreme yeteneği ile eşdeğerdir. DNA hasarlı sperm fertilizasyon gerçekleştirebilir,ancak aneuploidy oranı yüksek embriyo oluşumu, erken dönem gebelik kayıpları,epigenetik değişimlere bağlı olarak metabolik hastalık riski, çocukluk çağı kanserleri gibi problemler halen araştırma konularını oluşturmaktadır.

Sperm DNA hasarı oluşturan mekanizmalar * Anormal kromatin paketlenmesi Manicardi et al., 1995, Sakkas et al., 1999 * Reaktif oksijen türevleri (ROS) Sharma & Agarwal, 1996; Aitkin & Krausz,2001; Agarwal & Said,2005; Lewis & Aitkin, 2005 * Sperm apoptozu Sakkas D. et al. 1999 Shen H. et al 2000 Agarwal A. Et al 2003,2004,2007

Spermatogenezde histon-protamin degişimi

Spermde Kromatin Kondensasyonu

Protaminler fertilizasyonda maternal histonlar ile yer değiştirirler

Sperm chromatin condensation in normal development (15 % histone, 85% protamine) Zini et al 2005

İnfertil grupta protamin-histon problemi görülmektedir Zzhang et al 2006

Sperm kromatin hasarı neden bir problem olarak görülür Çok sayıda çalışma ile fertilite ile ilişkisi gösterilmiştir. Kromatin hasarlı babalardan doğan çocuklarda doğum defektlerinde artış riski vardır.(RR 3.00) Ngo et al., Int J Epi 2006 Kimyasal boyalara maruz kalan babaların çocuklarında doğumsal defektler görülmüştür.(OR 6.2) Hooiveld et al., Occup Environ Med 2006 Böcek öldürücü ilaçlara(pestisid) maruz kalan babaların çocuklarında anensefali riski artmıştır.(OR 2.5) Lacasna et al., Occup Enviro Med 2006 Sigara içen babaların çocuklarında çocukluk çağı kanserlerinin artışı. (OR 3.8) Ji et al J Natl Can Inst 1997

ANORMAL KROMATİN PAKETLENMESİ IVF SONUÇLARINI ETKİLEMEKTEDİR Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results M.V. Filatov1,3, E.V. Semenova1, O.A. Vorob'eva2, O.A. Leont'eva2 and E.A. Drobchenko1 1999. Abstract This study was initiated to determine the relationship between the fertilizing potential of spermatozoa and abnormalities in the compact packing of their chromatin which occurs in the final stage of male germ cell differentiation. Chromatin packing involves disulphide bridge covalent cross-linking. The degree of packing was determined from the accessibility of DNA to a fluorescent dye, ethidium bromide, following detergent treatment of the spermatozoa. The amount of dye bound was determined by flow cytometry in the presence or absence of heparin, a polyanion which removes only non-disulphide bridge-linked proteins. The results of a number of different sperm samples were compared with their results following in-vitro fertilization, and a relationship between disordered sperm chromatin packing and rates of embryo cleavage was observed. This study suggests that abnormal chromatin packing in spermatozoa may contribute to male fertility. Key words chromatin packing ethidium bromide fertility disorder flow cytometry human spermatozoa

Protamine levels vary between induvidual sperm cells of infertile human males and correlate with viability and DNA integrity Aoki et.al 2006 Sperm nuclear histone H2B:correlation with sperm DNA denaturation and DNA stainability. Zini et al 2008 Genome-wide analysis identifies changes in histone retention and epigenetic modifications at developmental and imprinted gene loci in the sperm of infertile men Hammoud et al 2011 Anomalies in sperm chromatin packaging:implications for assisted reproduction techniques. Tarozzi et al 2009

Sperm Kromatin Kondensasyon Testleri Toluidin Blue (TB) Chromomycin A3 (CMA3) SDS+EDTA Anilin Blue (AAB) Acridine Orange Feulgen SCSA

Kromatin kondansasyonu

Morfoloji ve Kondensasyon Normal sperm morfolojisi ile kromatin paketlenmesi arasında anlamlı ve negatif korelasyon r = 0.40 (P = 0.001) ve r = 0.33 (P = 0.001 CMA3 ve AAB için bulunmaktadır. Franken DR et al. Andrologia. 31(6):361-6. 1999

Sperm Morfolojisi ve Kromatin Kondensasyon defektleri İlişkisi İrez ve Avcı 2004 TB P= 0.01

Kondensasyon defekti 1.% 100 2.% 20 3.% 50 4.%70 5.%80 İrez, Avcı,Kuruş, 2005

Kromatin kondensasyonu 254 subfertil olgu CTF IVF İrez ve ark 2006 unpublished Yaş>35 47 41.89 ± 22.76 Yaş<35 54 40.50 ± 20.99 mot >50 4 52.50 ± 26.61 Mot<50 99 36.02 ± 20.40 Mot<10 6 20.6 ± 16.46* Mot=0 4 15.25 ± 18.39* Morf>14 6 54.33 ± 18.31 Morf<14 97 31.80 ± 19.90* Kons>20 90 44.43 ± 20.42 Kons<20 19 17.33 ± 18.20*

OAT grubunda sonuçlar Normo 16 59.93±22.78 OAT 49 21.65±17.95* +varicocele 14 25.70±19.02* +smoking 17 10.71±7.89** -sm or vari. 18 21.87± 18.93* Total 114 *p <0.05 **p<0.001 İrez ve ark 2007

ICSI results (aniline blue staining)2005-2006 CTF (n=234) Chr. Cond. > 30 % 29-20 20-10 10-5 <5 n 91 45 36 27 35 % Pregnancy 39 31 11 3.5 0 T.Irez et al (unpublished)

The predictive value of sperm chromatin condensation test in infertility laboratory T.İrez ve ark 2007, ASRM N=526 olgu n Kromatin kondensasyonu Fertil 19 56.93±15.05 Normospermik 16 59.93±22.78 Varikosel (+) 64 32.79±20.82* Varikosel (-) 426 41.85±21.29 Sigara (+) 164 38.40±20.54* Sigara (- ) 228 42.53±21.51 Şiddetli Asthenospermi 26 20.91±6.49** * p<0.05 ** p< 0.01

Smoker non smoker p n=120 n=125 Effects of Smoking Cigarette on Intrauterine Insemination Outcomes T.İrez, P.Öcal, M.İdil, S.Kaleli, Y.Uyar, B.Aydogan, N.Erol, S.Sahmay,FIGO 2009 Smoker non smoker p n=120 n=125 Sp.conc (mil/ml) 81.00±73.90 74.19±40.00 0.077 Motility 31.57±13.52 33.96±14.67 0.407 Nor.morph(Kruger) 4. 65±3.99 5. 04±4.18 0.593 Prepared conc. 7.85 ±9.75 8.13 ±9.83 0.780 Leucocyte conc 2.98±0.87 0.76± 011 0.038 Chromatin conden. 27.25± 25.85 49.13± 15.92 0.048

Irez et al 2009,FIGO IUI Pregnancy rate

The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation JOSE LUIS FERNÁNDEZ*,,, LOURDES MURIEL*,, MARIA TERESA RIVERO*,, VICENTE GOYANES*,, ROSANA VAZQUEZ AND JUAN G. ALVAREZ, Sperm Halo test-SCD test

Sperm kromatin stabilite testi (SDS-EDTA) ICSI uygulamasında fertilizasyon belirlemede Kruger’e göre daha sensitif

SCD test ICSI sonuçları T.İrez et.al. 2007 Pregnancy (+ ) (-) p N 19 20 Aniline blue 35.50 ±21.70 34.77 ±24.31 ns SCD 1 36.00 ±10.23 14.33 ±11.41 <0.05 SCD 2 51.70 ± 27.62 63.00 ±25.13 ns SCD 3 13.30 ± 23.67 23.77 ±28.15 ns

SCD(Sperm Chromatin Dispersiyon) Basit ,ucuz Asit denatürasyonu sonası nükleer proteinlerin ortaya çıkması ve agoroz jelde halo vermesi * SDS-EDTA ile benzer sonuçlar

Antioxidants and semen quality Wong et al., F&S, 77, 491, 2002 108 fertile & 103 subfertile men • Double-blind, randomized, placebo controlled • 4 groups – Zinc sulphate 66 mg, folic acid 5 mg – Placebo + FA, placebo + Zn, Zn + FA, 2 placebos • Results ⇒ Zinc and folate: associated with ⇑ total normal sperm count (74%) and ⇑ sperm morphology (4%)

Antioxidant and ICSI outcome Greco et al., HR, 20, 2590, 2005 38 men: >= 15 % DFI 1 failed ICSI attempt • 1gr Vit C & 1gr Vit E for 2 months • 29 (76 %): decrease in DFI ⇒ 2nd ICSI attempt • Results No difference in FR, cleavage rate & embryo morphology Significant ⇑ clinical PR (48.2 vs 6.9 %) and IR (19.6 vs 2.2 %

Antioxidant and IVF/ICSI outcome Tremellen et al Antioxidant and IVF/ICSI outcome Tremellen et al., Aust N Z J Obstet Gynaecol, 47, 216, 2007 60 men with severe OAT • Randomized, double-blind placebo-controlled trial • 3 months Menovit or placebo before IVF trial • Results No difference in FR & embryo morphology Significant ⇑ viable* PR (38.5 vs 16 %) * viable = > 13 weeks

antioxidants ↔ sperm DNA fragm & decondensation Menezo RBMOnline, 14, 418, 2007 Study-population – >= 2 previous IVF-ICSI failures – DFI & sperm decondensation (SCMC) before and after 90 days of Tt – Tt: antioxidant vitamins + Selenium + zinc • Results ⇒ decrease in DNA-fragmentation ( - 19.2 %) ⇒ Increase in sperm decondensation ( + 22.8 %) • Comment Vit C: able to open the cystin net – may interfere with paternal gene activity

L-Carnitine kombinasyonu(L carnitine,Co enzyme,Fructose,Zn,Acetyl L carnitine,Folic acid, C vit,Se,Citric acid)uygulaması ile ilgili preliminer sonuçlar Fertil (26) İnfertil (31) p Yaş 33.6 ± 3.9 34.1 ± 2.7 NS FSH 5.8 ± 3.6 6.1 ±3.1 NS E2 44.7 ± 8.9 52.2 ± 5.5 NS VKI 24.1 ± 2.8 23.9 ± 4.5 NS

Irez ve ark 2011 Fertil grup (26) İnfertil grup (31)   Fertil grup (26) İnfertil grup (31) İnfertil tedavili grup(20) Sperm konsantrasyonu 32.4±15.2 15.3±12.1 29.6±9.9* Sperm motilitesi 52.3±16.8 26.1±10.2 39.5±8.8* Sperm morfolojisi 4.9±2.3 2.8±1.9 3.7 ± 2.1 Kromatin kondensasyonu 68.1±6.3 38.4±7.1 45.4±5.7* SDS-EDTA 42.4±5.6 15.8±3.3 27.3±6.8* Gebelik(%) 100 15 *

Sonuç Sperm kromatin kondansasyonu infertil hastaların takibinde kullanılabilir bir test olmaya adaydır Kombine antioksidanların kromatin kondansasyonu ve dekondansasyonu üzerine olumlu etkileri görülmüştür.