Arş. Grv. E. Sacide ÇAĞLAYAN SNP ANALİZLERİ Arş. Grv. E. Sacide ÇAĞLAYAN

GENETİK VARYASYONLAR MUTASYON Bir populasyonda,%1’den daha az sıklıkta görülen nadir varyantlardır. POLİMORFİZM Bir populasyondaki sıklığı en az %1’dir.

Polimorfizm Aynı türün farklı bireyleri arasında iki veya daha fazla farklı dizinin varlığıdır. DNA replikasyonu sırasında oluşan hatalar sonucu meydana geldikleri düşünülür. İnsan DNA’sında gen diziliminin %99.9’u birbirine benzemektedir. İnsanlar arasındaki genetik çeşitlilik %0.1’lik farklılıktan ileri gelmektedir.

Genetik Farklılıklar Fiziksel özelliklerde farklılıklar Hastalıklara yatkınlık ve dirençte görülen farklılıklar İlaç veya besin metabolizmasında görülen farklılıklar

Polimorfizmler genel olarak 3 grupta incelenir. Tek nükleotid polimorfizmleri Mikrosatellit tekrarları İnsersiyon ve delesyonlar

Nonfonksiyonel Protein ya da Normal Dizi Fonksiyonel protein Polimorfizm Nonfonksiyonel Protein ya da Protein Kaybı Mutant Dizi

TEK NÜKLEOTİD POLİMORFİZMLERİ (SNP) Belirli bir baz pozisyonunda meydana gelen tek nüklotid değişiklikleridir. Tüm genetik varyasyonların %90’ını oluşturur.

SNP Transisyon (Pürin-Pürin, Primidin-Primidin) Transversiyon (Pürin-Primidin)

İnsan genomunda 10-30 milyon SNP olduğu tahmin edilmektedir. İki farklı birey arasında 1250 bp’de bir farklılık olduğu tahmin edilir. Belirli bir populasyonda sıklığı genellikle %1’den fazladır.

SNP Etkileri Sessiz Protein Fonksiyonunu Değiştirir Bir amino asit sekansını değiştirir Regülatuar sekansın fonksiyonunu değiştirir.

Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir . Gen kodlayan bölgelerdeki SNPs’in sayısının 10000-50000 dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir. Bunların belirli bir populasyonda görülme sıklıkları %1’in altında olabilmektedir. Bazı SNP, regulatuar sekansları değiştirmekte ve gen ekspresyonunu dolaylı yoldan etkilemektedir.

Apolipoprotein E Apo E için 3 SNP alleli tanımlanmıştır: E2, E3 and E4. Bu 3 allelin varlığı 3 varyant proteinin ortaya çıkmasına neden olur: apo 2, apo 3 and apo 4.

E2 alleli en yaygın görülen alleldir (%90). E2 allelinden iki kopya taşıyan bireyler klinik olarak normaldir. Bunun dışındaki bireylerde, premature arteriyel hastalıklara yatkınlığa yol açan anormal kan lipit düzeyi ile birlikte tip III hiperlipidemi görülür. Ancak, obezite, yaş, cinsiyet ve hormonal etkiler gibi faktörlerin etkisiyle, E2 homozigot bireylerde de arteriyel hastalıklar gelişebilmektedir.

E4 alleli ise Alzheimer hastalığı ile ilişkilidir. E4 allelinden iki kopya taşıyan bireyler, hastalığa karşı duyarlıdır ve bunlarda 5-15 yaş arasında demans gelişebilmektedir. Batı populasyonunda taşıyıcı olmayan bireylerle karşılaştırıldığında, E4 taşıyıcılarında Alzheimer gelişimi için rölatif risk, tek kopya taşıyanlarda yaklaşık 3, iki kopya taşıyanlarda 6-15’tir.

Apoliprotein E 112. pozisyon 158. pozisyon e2 cys e3 arg e4

Bu pozisyonlardaki sistein arjinin değişimi, C-T transisyonundan ileri gelmektedir.

SNP’in Kullanım Alanları Tanı ve Risk Profillenmesinde Aday Gen Tayini ve Haritalamada Polimorfizm Testlerinde Epidemiyolojik Çalışma Planlamasında Farmakogenomik ve Fizyolojik Genomikte Çevresel Uyaranlar ve Diete Yanıtta Adli Tıpta

SNP’in Hastalıklarla İlişkisi Bazı yaygın hastalıklar multifaktöriyeldir. İnsan populasyonları arasındaki genetik farklılıklar nedeniyle bazı populasyonlar, bazı hastalıklara daha duyarlıdır.

Populasyonlar arasında görülen genetik farklılıklar, hastalıklara karşı duyarlılık, direnç ve hastalık prognozunu etkileyebilmektedir. Epidemiyolojik ve biyomedikal araştırmalar, farklı populasyonlarda hasta bireyler ve sağlıklı kontroller arasındaki SNP farklılıklarını ortaya koymaktadır.

Kanser, Diabetes mellitus, Alzheimer, bazı kardiovasküler hastalıklar ve Migren gibi hastalıklar SNP ile yakın ilişkilidir.

SNP taramalarında, hangi varyant allellerin hastalıkla yakın ilişkili olduğu belirlenebilmektedir. Çeşitli hastalıklara özgü SNP profilleri belirlenmiştir. DNA örneklerinde spesifik SNP allelleri incelenerek bireylerin hastalıklara yatkınlıklarını belirlemek amacıyla tarama yapılabilmektedir.

Farmakogenetik ve SNP Yıllardır, bireyler arasında ilaçlara karşı gelişen yanıtta gözlenen farklılıklar araştırılmaktadır. SNP, ilaç matabolizmasında rol alan enzimlerin fonksiyonlarını değiştirir. Farmakogenetik, hastaların genotipine uygun ilaç kullanımı üzerine yoğunlaşmıştr.

SNP ve Kanser SNP DNA tamir mekanizmasından sorumlu genlerde, Karsinojenlerin metabolizma ve detoksifikasyonundan sorumlu genlerde

Kanser, kimyasal karsinojenlerin aktivasyonunda artış ve hücrenin mutajenik hasara karşı geliştirdiği detoksifikasyon ile tamir yeteneğinin azalması sonucu oluşmaktadır. Genotipik varyasyonların tanımlanması ve kanserle ilişkisinin ortaya konması, kanser etiyolojisinin daha iyi anlaşılması ve hastalık riskinin ve kemoterapiye yanıtın tahmin edilebilmesine olanak sağlayacaktır.

İlaç metabolizması ve DNA tamirinde rol alan, kanserle ilişkili genlerde varyant alleller tanımlanmıştır. MTHFR (metil tetrahidrofolat redüktaz) GST (Glutathione S-Transferases ) Sitokrom P450 monooksijenaz NAD(p)H Quinone Oksidoredüktaz N-Asetil Transferaz

MTHFR MTHFR geni kromozom 1’de (1p36.3) lokalizedir Folat metabolitlerinin homosistein remetilasyon yolu ile uzaklaştırılması ve DNA-RNA biyosentezinin doğru bir biçimde gerçekleşmesini sağlar. DNA’nın mutajenik hasarını önler. İlişkili SNP C677T ve A1298C’dir.

GST Gst enzimi, ekzojen ve endojen reaktiflerin detoksifikasyonunu katalizler. GST M1 ve GST T1 null allellerinde meydana gelen delesyon polimorfizmi enzim aktivitesinin kaybı ile sonuçlanır. Sigara içenlerde akut lösemi, kolorektal adenokarsinoma, tiroid kanseri, mide, akciğer ve pankreas kanseri riskini arttırır.

NAD(p)H quinone Oxidoreductases 16. kromozomda lokalizedir. Hücreleri oksidatif hasardan korur. C609T polimorfizmi, enzim aktivitesinin azalması ile sonuçlanır. Akciğer kanseri ve akut lösemi riski artar.

CytochromeP450 monooxigenases Sitokrom monooksijenaz enzimi, ilaç metabolizması, endojen ve ekzojen karsinojenlerin uzaklaştırılması ile yakın ilişkilidir. Cyp1A1 polimorfizmi, akut lösemi ve erken yaşta sigaraya başlayan kadınlarda postmenapozal akciğer kanseri riskini arttırır.

N-Acetyle Transferases NAT 1 ve NAT 2 genleri kromozom 8’de lokalizedir. Aromatik ve heterosiklik karsinojenlerin N-asetilasyon (deaktivasyon) ve O-asetilasyon (aktivasyon) mekanizmalarında rol alır. NAT2’deki T341C ve C481T SNP’lerinde enzim aktivitesinde azalma görülür. Akut lenfositik lösemi ve sigara içenlerde üriner mezhane kanseri riski artar.

SNP İdentifikasyonunda Kullanılan Yöntemler Bilinen SNP’lerin Analizi Yeni SNP İdentifikasyonu

Bilinen SNP’in Analizi PCR ARMS (Allele Özgü Amplifikasyon) Oligonükleotid Ligasyon Testleri Minisekanslama FRET (TaqMan Genotipleme) Çip Teknolojisi

Bilinen SNP’lerin Belirlenmesi Jel Analizleri Restriksiyon Enzimleri ile PCR Analizi ARMS Oligonükleotid Ligasyon Analizi Minisekanslama

PCR En yaygın yöntemdir. Bir çift restriksiyon enzimi kullanılır. Özellikler bir restriksiyon bölgesini ortadan kaldıran ve yeni bir restriksiyon bölgesi oluşturan SNPs analizi için uygundur. Farklı restriksiyon değişim paternleri belirleyebilir.

ARMS Primerler, normal DNA sekansları ile eşleşir. Sadece normal bireylerde amplifikasyon gerçekleşir.

Oligonükleotid Ligasyon Analizi Hibridizasyon spesifik oligonükleotid problarla olur.

Diğer Genotipleme Teknolojileri FRET Teknolojisi Chip Teknolojileri

Yeni SNP İdentifikasyonu Konformasyon Temelli Mutasyon Tarama Direk DNA Sekanslama

Konformasyon Temelli Mutasyon Tarama SSCP * En yaygın kullanılan metodtur. * Tek iplikli DNA ipliğinin nondenature jeldeki mobilitesinin belirlenmesi esasına dayanır.

SSCP

KAYNAKLAR Alan F Wright. Genetic Variation: Polymorphisms and Mutations. MRC Human Genetics Unit, Edinburgh, UK, 2005 http://www.hpcgg.org/Genotyping/index.jsp?name=servicesforresearchers&subname=genotyping http://en.wikipedia.org/wiki/Single_nucleotide_polymorphism www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/snps.shtml www.ornl.gov/sci/techresources/meetings/brookes.shtml -

TEŞEKKÜRLER