CGH (Comparative Genomic Hybridization) HALİL ÖZBAŞ Afyonkarahisar Kocatepe üniversitesi Tıbbi Genetik Doktora Programı 20 Mart 2008 Afyonkarahisar

İçerik Genetik tanı yöntemleri ve CGH CGH ın ortaya konulması CGH / Standart Multicolor FISH CGH ın temeli CGH avantajları CGH Aşamaları CGH protokolü uygulamada önemli noktalar Prob işaretleme Görüntü Elde etme CGH çalışmalarının gelişimi CGH'in uygulama alanları Array-CGH

Komparatif genomic hibridizasyon(CGH)

Comparative Genomic Hybridization (CGH) CGH sitogenetik tekniğini ilk defa, Kallioniemi ve ark. 1992’de Science’da yayınlattıkları çalışmaları ile ortaya koydular. Kallioniemi A, Kollioniemi OP, Sudar D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. 1992. Comparative Genomic Hybridization for moleculer cytogenetic analysis of solid tumor. Science. 258(5083):818-821.

Kromozomal bozukluları daha kapsamlı ve detaylı tesbit edebilecek yöntem CGH CGH a göre Standart Multicolor FISH tekniğinin dezavantazları vardır: İnce bozuklukları içeren küçük kromozomal bölgelerin tesbitinde yetersiz kalması Metafaz plaklarının gerekli olmasına karşın bir çok vakada metafaz elde edilemediğinden analizlerin interfazda gerçekleştirilmesi İnterfazdaki kromozomal bozukluğun tesbitinin güç olması

CGH Comparative Genomic Hybridization ( Karşilaştırmalı Genomik Hibridizasyon ) CGH tekniği; temeli FISH’e dayanan, farklı floresan boya ile boyanmış test (hasta) ve referans DNA örneklerinin normal kromozomlara bağlanması ile elde edilen floresan renk farklılıklarını gösteren bir sitogenetik yöntemdir. Yöntem ile hasta DNA’ sında kromozomal kayıp (loss) veya belli bir bölgenin amplifikasyonu (gain) gösterilir.

CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon) Genom boyunca DNA dizisindeki kopya sayısı değişimlerini inceleyen bir moleküler sitogenetik teknik Bu teknik, kazanım (duplikasyon, insersiyon veya amplifikasyon) veya net kayıp (materyalde delesyon) gibi kromozom anomalilerinin sınıflandırılmasına olanak sağlar

Yöntemin avantajları 1 İki renkli görüntüleme sistemi kullanılması sonucunda metafaz plağı üzerinde kromozom anomalilerinin normal karyotip analizine göre daha güvenilir saptanabilmesi ve en az iki genomun bir birleri ile karşılaştırılmasına olanak sağlaması.

Yöntemin avantajları 2 Temel avantaj DNA örneklerinin kullanılarak tüm genomun tek bir deneyde görüntülenebilmesi Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli olması Test örneği için metafaz kromozomlarının gerekli olmaması Katı tümörlerin çalışılmasında da elverişli olması

Yöntemin avantajları 3 Cgh bütün genomun dengesiz kromozomal materyalinin analizine olanak sağlar. Kromozomal dengesizlikleri tespit edecek moleküler sitogenetik bir yöntem olarak daha önceden kullanılmayan DNA nın kullanımını gündeme getirmiştir. Tümör dokularındaki genetik değişikliklerin araştırılmasında yaygın olarak kullanılabilmesi

Yöntemin avantajları 4 Çok az hücreden elde edilen az miktardaki bir DNA dan analiz CGH ile PCR ın kombinasyonu ile mümkündür. Genomdaki bilinmeyen yeniden düzenlemelerin tesbitinde “reverse painting” yönteminin kullanılması parlak bir gelişme olmuştur.

Yöntemin avantajları 5 Belirli bir genomun tamamındaki dengesiz kromozomal materyalin detaylı ve doğru analizi için Daha spesifik olarak da özelikle dengeli genomdan ince sapmalar olduğu zaman CGH gerekli olur.

CGH Tekniğinin Aşamaları Test ve Referans hücrelerden genomik DNA eldesi, Elde edilen DNA örneklerinin farklı renkte florokromlarla [Cy 3 (yeşil) ve Cy5 (kırmızı)] işaretlenmesi, Ard arda tekrarlanan bölgelerden kaynaklanabilecek hatalı eşleşmeleri önlemek için Human Cot-1 DNA ile muamele, Normal hücrelerden metafaz plağı eldesi ve denatürasyonu, Farklı renkte florokromlarla işaretli test ve referans hücrelerden elde edilen DNA materyalleri ile metafaz plağının co-hibridize edilmesi, Metafaz plağı üzerinde florokromlardan kaynaklanan renk farklılıklarına göre kromozomlardaki kayıpların (loss) veya kazançların yani amplifikiye olan bölgelerin (gian) tespiti .

CGH Tekniğinin Aşamalarını Gösteren Şekil

CGH Tekniğinin Aşamalarını Gösteren Şema

DNA from Disease Tissue Comparative Genomic Hybridization (CGH) DNA from Disease Tissue (TEST) DNA from Normal Tissue (CONTROL) Label Incorporating (RED Fluorescent) Label Incorporating (GREEN Fluorescent) Hybridise to Normal Metaphase Chromosome -2 0 2 (log2 ratio) Amplification Deletion

CGH protokolü uygulamada önemli noktalar CGH protokolü birçok standart FISH protokolü ile çok benzerdir. Ancak iyi CGH test sonucu elde etmek için bir çok noktada özel dikkat göstermek gerekir.

CGH protokolü uygulamada önemli noktalar Normal hücrelerden metafaz plağı eldesi ve denatürasyonu ( iyi boyanmış kromozomların olduğu sitoplazmik rezüdülerin olmadığı preparatların hazırlanması önemlidir.) Hücrelerden genomik DNA eldesi (genomik prob DNA nın kalitesi CGH ile tesbit edilecek kromozomal dengesizliğin sensitivitesini etkiler.) Az miktaradaki genomik DNA nın üniversal PCR ile amlifikasyonu (DOP-PCR degenerated oligonükleotid primerler ) DNA nın izole edildiği hücre sayısının çok az (5- 500 hücre) olduğu zamanlar kullanılır.

CGH protokolü uygulamada önemli noktalar Test ve referans örneklerden DNA izolasyonu için taze veya dondurularak saklanan homojen doku veya hücre popülasyonları kullanılır.

DNA’nın İŞARETLENMESİ Test ve referans doku veya hücrelerden elde edilen genomik DNA’nın farklı renkte florokromlarla işaretlenmesinde yaygın olarak 3 yöntem kullanılır: Nick Translasyon, Random(Rastgele) Primerlerle PCR, Kimyasal yöntem.

PROP İŞARETLEME FISH çalışmalarında en çok kullanılan DNA probu işaretleme yöntemi Nick Translation yöntemidir. Bu yöntemde Biotin ve digoxigenin kullanılır. Biotin ve digoxigenin kullanılmasının nedeni sensitivitesi ve uygulama kolaylığıdır. Biotin test DNA sının işaretlemesinde Digoxigenin Kontrol DNA sının işaretlemesinde kullanılır.

Nick Translasyon Yöntemi ile DNA’nın İşaretlenmesi

Rastgele Primerler kullanarak DNA’nın İşaretlenmesi

CGH için prob olarak çok miktarda IRS (interspersed repetetive sequence)içeren genomik DNA kullanılır. IRS lerden gelen non spesifik hibridizasyon sinyallerini baskılamak için DNA probları Cot 1 DNA ile combine edilirler.

Kromozomal DNA nın preparat üzerinde denaturasyonu (denaturasyon yeterli değilse iyibir hibridizasyon elde edilemez)

Görüntü Elde etme Floresan sinyaller konvansiyonel epifloresan mikroskopi ile izlenir ve uygun bir kamera sistemi ile görüntülenir.Kabaca hibridizasyon kalitesi şu kriterlere göre belirlenir. Eğer test DNA sı bir erkekten alındı ise zayıf boyanmış bir X kromozomu görülebilmelidir. Kromozomlar veya çekirdek dışında arka plan çok az boyanmış olmalıdır.

Görüntü Elde etme Tümör genomundaki bütün kromozomal dengesizliklerin tamamını kapsamlı ve detaylı şekilde araştırmak için florasans yoğunluğunu niceliksel ölçüm gereklidir. Bu amaç için CCD (charged-coupled device) gibi duyarlı kamera kullanarak dijital görüntü elde edilir.

CGH çalışmalarının gelişimi kromozomal materyalin gross değişikliklerinden kaynaklanan dengesizlikler İyi bir CGH da floresan mikroskopla görülebilmektedir. Uzun çalışmalarda florsan sinyallarinin solması ile dijital görüntülerin monitörde karşılaştırılması için FITC ve rhodamine floresans kullanılır.

CGH çalışmalarının gelişimi Niceliksel CGH ın gelişimi için değişik bilgi sistemleri kullanan birçok yazılım uygulamaları gelişti. Bu gelişmeler için zorunlu olan gereksinmeler: Niceliksel analize uygun CGH preparatlarının objektif seçim kriterlerinin tanımlanması Kromozomların segmentlenmesi Floresans background ın tahmin edilmesi Spesifik kromozomal bölgelerin dengeli represantasyonu için central değer indikatör kriterlerinin tanımlanması Düşük veya yüksek kopya sayılarındaki dengesiz segmentler için eşik değerin belirlenmesi

CGH'in uygulama alanları Kanser genetiği Prenatal tanı Postnatal tanı (özellikle marker kromozom köken tayini )

UYGULAMALAR CGH evrim çalışmalarında türlerin karşılaştırılmasında kullanılabilir. Şuanda en çok kullanım alanı tümör sitogenetiğidir. Özellikle kromozom bantlamanın çok zor olduğu solid tümör dokularında kullanılmaktadır. CGH proto-oncogen ve tümör supressör genlerin tespitinde önemli bir metot olma yolunda ilerlemektedir.

CGH ile Belirlenemeyen kromozom anomalileri Albertson et al., 2003

CGH ile Belirlenebilen kromozom anomalileri Albertson et al., 2003

Array Temelli CGH (A-CGH) CGH Avantajları Microarray Teknolojisi Array Temelli CGH (A-CGH) Tüm genomun yüksek kararlılıkta analizi

Array-CGH İlk kez 1997 de Solinas-Toldo ve ark. hedef (target) diziyi cam matriks üzerine immobilize ederek array-CGH’nin temelini attılar. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Dohner H, Cremer T, Lichter P. 1997. Matrix-based comparative genomic hybridisation: biochips to screen for genomic imalances. Genes Chromosomes Cancer. 20(4):399-407.

Daha sonra 1999 yılında Pollack ve ark Daha sonra 1999 yılında Pollack ve ark. array platformu üzerine cDNA dizisini (target) immobilize ederek genom düzeyinde DNA daki kopya sayısındaki değişmeler incelendi. Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, Eisen MB, Pergamenschikov A, Williams CF, Jeffrey SS, Botstein D, Brown PO. 1999. Genom-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat. Genet. 23(1): 41-46.

A-CGH Tekniğinin Aşamaları, Test ve referans hücrelerden genomik DNA izolasyonu, İzole edilen bu DNA materyalinin farklı renkte florokromlarla [Cy 3 (yeşil) ve Cy5 (kırmızı)] işaretlenmesi, Ard arda tekrarlanan bölgelerden kaynaklanabilecek hatalı eşleşmeleri önlemek için Human Cot-1 DNA ile muamele, BAC, PAC, kosmid, cDNA, oligonukleotid ve PCR türevli probların cam matriks üzerine immobilizasyonu, Hibridizasyon aşaması, Bilgisayar ortamında çeşitli analiz programları ile floresan sinyallerin tanımlanarak sonucun yorumlanması.

CGH ve A-CGH Tekniklerinin Karşılaştırmalı Olarak Gösterilmesi

Test ve Referans hücre veya dokulardan izole edilerek farklı renklerde florokromlarlla boyanan DNA örnekleri, daha sonra genomdaki ard arda tekrarlanan bölgelerden kaynaklanabilecek hatalı eşleşmeleri önlemek için Human Cot-1 DNA ile muamele,

Standart bir microarray matriksi, yaklaşık olarak 100 µm çapında, bir cm2’sinde 40.000 spot (benek) içerir. Buna göre cam matriks üzerine immobilize edilen problarla test ve referans örneklerden elde edilen farklı renkte florokromlarla işaretlenmiş genomik DNA’ların hibridizasyondan sonra cam matriks üzerinde elde edilecek floresan ışığın şidetti verilerin doğru analiz edilmesinde önemlidir.

A-CGH için microarray matriksinde kullanılan problar BAC, PAC ve kozmitler, PCR ve ya cDNA ürünleri, Oligonükleotidler kullanılır. BAC, PAC ve kozmitlerden elde edilen problar, PCR, cDNA, Oligonukleotidlerden elde edilen problara göre daha güçlü sinyal yoğuluğu verirler.

Ligation-mediated PCR (LM-PCR), Herhangi bir BAC klonundan elde edilecek probların amplifikasyonunda yaygın olarak 3 yöntem kullanılır: Ligation-mediated PCR (LM-PCR), Degenerate oligonucleotide primer PCR (DOP-PCR), Rolling circle amplification Bacillus subtilis in ф 29 DNA polimeraz enzimini kullanarak (RCA). Mantripragada et al., 2004

Blocking the repeat sequence by Cot-1 DNA BAC clone BAC Array Chip Blocking the repeat sequence by Cot-1 DNA Co-Hybridization Reference DNA Test DNA Figure1 Fluorescent image scanning and data processing Loss Diploid Gain

Problar, farklı PCR yöntemleri kullanılarak in situ olarak amplifikiye edildikten sonra cam matriks üzerine immobilize edilirler. Cam matriks üzerine immobilize edilen problar daha sonra farklı renkte florokromlarla işaretlenmiş test ve referans DNA örnekleri içeren hibridizasyon solüsyonu ile 16-72 saat süresince hibridizasyona tabi tutulurlar. Hibridizasyondan sonra fazla olan işaretli DNA örneklerini ortamdan uzaklaştırmak için cam matriks yıkama işlemine tabi tutularak kurutulur Tarayıcıda taranan görüntü bilgisayar ortamına aktarılarak çeşitli biyo informatik programları ile verilerin değerlendirmesi yapılır.

Tekniğin Kullanım Alanları, Kanser araştırmalarında, Haritalamada, Diagnostikte, Epigenetik modifikasyonlara yönelik çalışmalarda,

Hupe et al, Bioinformatics Sep 20 2004

A-CGH Tekniğinin Avantajları, Farklı renklerde florokromların kullanılması genom boyunca DNA kopya sayısındaki değişimlere bağlı olarak ortaya çıkan kromozom anomalilerinin güvenilir şekilde tespiti ve sınıflandırılabilmesi, Birden fazla genomun birbirileri ile karşılaştırılabilmelerine olanak sağlaması, Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli olması, Metafaz plağı gerekli değil, Yüksek kararlılık ve verim, DNA üzerindeki tek baz değişikliklerinin bile saptanabilmesi.

A-CGH Tekniğinin Sınırlandığı Noktalar, Alanında uzman kişilere ihtiyaç duyması, Heterojen doku ve hücre populasyonları ile çalışmanın zorluğu, Standardizasyonun zorluğu.

SABRINIZ İÇİN TEŞEKKÜRLER