EPİGENETİK MODİFİKASYONLAR VE ERKEK İNFERTİLİTE İLİŞKİSİ Yrd. Doç. Dr. Hakan GÜRKAN Trakya Üniv. Tıp Fak. Tıbbi Genetik A.D.

EPİGENETİK NEDİR ?

EPİGENETİK NEDİR ? Temel DNA dizi değişikliği olmadan, gen ifadesinde veya hücresel fenotipte hücre bölünmesi (mitoz ve/veya mayoz) boyunca bir nesilden diğerine geçebilen kalıtımsal değişikliktir.

Monozigotik ikizler ortak bir genotipi paylaşırlar ve Epigenetik: Aynı genom, farklı fenotip, farklı gen anlatım profili Monozigotik ikizler ortak bir genotipi paylaşırlar ve genetik olarak identiktirler Önemli fenotipik uyumsuzluk sonucu: Mental Hastalıklar Kanser

Agouti “İkiz” Kardeşler

Epigenetik Değişim Ancak epigenetik değişimler geri dönüşümlü oluşları ve DNA’nın baz dizisinde bir değişime neden olmamaları gibi özellikleriyle genetik değişimlerden ayrılırlar.

EPİGENETİK MODİFİKASYONLAR NELERDİR? DNA metilasyonu, Histon metilasyonu, Histon asetilasyonu, Histon fosforilasyonu ve Kromatin yeniden düzenlenmesi gibi nükleozom konumunu değiştirerek tüm kromatin yapısı üzerinde doğrudan etki eden düzenlemelerdir.

EPİGENETİK MEKANİZMALAR Epigenetik mekanizmalar DNA ve histonlar arasındaki ilişkiyi düzenleyerek, genlerin transkripsiyonel olarak aktif veya inaktif olmalarını sağlarlar.

Epigenetik Mekanizmalar 1. Transkripsiyonel A. Histon modifikasyonları B. DNA metilasyonu 2. Post - transkripsiyonel RNAi Bu mekanizmalar esas olarak transkripsiyon regülatörlerinin DNA’ya ulaşabilirliğini etkilerler.

1. TRANSKRİPSİYONEL MEKANİZMALAR

A. Histon Modifikasyonları 1.Histon asetilasyonu / deasetilasyonu 2.Histon metilasyonu 3.Serin veya treoninlerin fosforilasyonu 4.Glutamik asitlerin ADP-ribozilasyonu 5.Histon ubiquitinasyonu

Nükleozomlar arası güçlü bağlantılar Hiperasetilasyon (sarı): Histon Asetilasyonu Hipoasetilasyon: Nükleozomlar arası güçlü bağlantılar Histone deacetylase Asetilasyonun 2 fonksiyonu vardır: Pozitif yüklü lizin rezidülerini nötralize eder. 2. Histon uçları ile yapısal proteinler arasındaki bağlantıları destabilize eder. Hiperasetilasyon (sarı): Nükleozomlar arası zayıf bağlantılar: Histon uçları DNA’yı sınırlamaz ve transkripsiyon faktörleri DNA’ya bağlanabilir.

Histon Modifikasyonu

Mekanizma: Acetylation of H3 or H4 leads to unfolding and accessibility of chromatin (histone acetyltransferases) Methylation of K4 of H3 = active gene expression Methylation of K9 of H3 = gene silencing

DNA METİLASYONU Gen ifadesini değiştirerek hücre fonksiyonlarını değiştiren ve bir metil grubunun kovalent şekilde DNA metiltransferaz (DNMT) katalizinde, bir CpG dinükleotidindeki Sitozinin 5. karbonundan yapıya eklenmesini ifade eden epigenetik bir modifikasyondur.

DNA METİLASYONU DNA metilasyonunun en önemli görevi gen regülasyonu’dur.

DNA metilasyon özellikleri Transkripsiyonal “silencing” Genomu transposizyondan koruma Genomik imprinting X inaktivasyonu Doku spesifik gen anlatımı

DNA METİLASYONU DNA metilasyonu, insanlarda ve pek çok memelide yalnızca Guanozin (G) tarafından takip edilen Sitozin (C) bazını etkiler. Yalnızca CpG alanlarında gözlenir.

DNA METİLASYONU

DNA METİLASYONU

DNA METİLASYONU İnsan DNA’ sındaki tüm CpG alanlarının % 70-80’ i metillenmiştir.

EPİGENETİK MODİFİKASYONLAR ve TRANSKRİPSİYON ÜZERİNE ETKİLERİ

CpG NEDİR ? CpG, Sitozin fosfo Guanin anlamına gelir. İnsanlarda CpG dinükleotidi sıklığının ölçüsü çok azdır, bu CG baskılanması olarak bahsedilen bir olaydır.

GC Baskılanması İnsan genomunun başından sonuna kadar 300- 3000 bç uzunluğundaki küçük alanlar haricinde, çok belirgindir. Bu alanlara CpG adacıkları denilmektedir ve genomun %1 kadarında bulunduğu düşünülmektedir.

CpG ADACIKLARI NEDİR ? Retinoblastoma gen bölgesindeki CpG adacıkları. Noktalı çizgi CpG alanlarının istatiksel olarak beklenen sıklığı (1/16) temsil etmekteyken, grafik ise Rb geninin ekzon ve intronlarını da içeren 180 kb lık DNA sekansındaki CpG alanlarının sıklığının istatistiksel ölçüsünü temsil etmektedir. İki CpG adacığının yeri oklarla gösterilmektedir. Yalnızca 5’ ucuna en yakın CpG adacığı genin promotoruna rastlamaktadır.

CpG ADACIKLARI CpG adalarının öncelikli olarak, ifade olan genlerin 5’ bölgesinde bulundukları gözlenmiştir ve insan promotorlarının % 60’ından fazlası bu CpG adalarını içermektedir.

CpG ADACIKLARI Promotorlardaki CpG adaları metillendikleri zaman gen sürekli sessiz hale gelir ve bu sessizlik mitoz bölünmeler boyunca aktarılır. Bu sebeple CpG adacıklarının metilasyonu epigenetik bir modifikasyonu temsil eder.

Bir genin metillenme derecesi neyi ifade eder ? Bir genin metillenme derecesi ile ifade edilme derecesi arasında ters bir ilişki vardır. Metillenme oranı gen ifadesi oranı

Bir genin metillenme derecesi neyi ifade eder ? Metillenme dokuya özgüdür ve bir kere gerçekleşince o dokunun bütün hücrelerine aktarılır.

DNA metilasyonu gen ifadesini nasıl kontrol eder ? 1- Metillenmiş promotor bölgelerine bağlanabilen proteinlerin hedef dizilere (sekanslara) bağlanarak, esas bağlanması gereken transkripsiyon faktörlerinin buralara bağlanmasını engelleyerek, 2- Transkripsiyon faktörlerinin metillenmiş sitozine bağlanmasını engelleyerek, 3- Kromatin yapısını değiştirerek transkripsiyon miktarında bir değişim gerçekleştirerek.

2. POST-TRANSKRİPSİYONEL MEKANİZMALAR RNA İNTERFERENCE (RNAi)

RNA interferens, çift zincirli RNA (double stranded RNA; dsRNA) tarafından başlatılan dizi spesifik post-transkripsiyonel gen sessizleştirme sürecidir.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Cinsiyet farklılaşmasını düzenleyen önemli olaylar örneğin; - “genomik imprinting” (genlerin sadece paternal ya da sadece maternal olarak ifade edilmesi, paternal gen aktif ise maternal gen suskundur), - X-kromozom inaktivasyonu ve - Embriyonik gelişim DNA metilasyonu ile ilişkilidir.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Metilasyon somatik hücrelere kalıcı şekilde aktarılırken, gelecek nesilde bu metilasyon işaretleri ortadan kaldırılarak yeniden oluşturulabilir. Genom kapsamında, oosit DNA’sı hipometillenmeye meyilliyken sperm DNA’sı hipermetilasyona meyillidir.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Fertilizasyonun ardından dişi ve erkek pronükleusları aynı gelişimi göstermediklerinden, dişi ve erkek gametlerindeki metilasyon seviyesi embriyoların gelişim potansiyellerini etkileyebilir. Gametlerdeki anormal metilasyon seviyesi, bu gametler normal görünseler de, implantasyon başarısızlıklarına neden olabilir.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Erkek germ hücrelerinde DNA metilasyonunun kazanımı mitotik ve mayotik germ hücrelerinde doğumdan sonra devam eder ve mayoz I’in pakiten evresinde tamamlanır.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Spermatogeneze özgü genleri araştıran çalışmalar, sperm genomunda doğru DNA metilasyonunun kazanılmasının, sperm olgunlaşmasının kritik bir yüzünü temsil edebileceğini ifade etmektedir.

DNA metilasyonu ve erken embriyogenez Metilasyon, erkek germ hücre serisinde, somatik dokular ile karşılaştırıldığında özgündür: Doğum öncesi fetal gonadda başlar ve postnatal spermatogenez süresince tamamlanır.

DNA metilasyonu ne zaman meydana gelir ? Spermatogenez ve epididimal taşınma sırasında meydana gelir. Sperm genomunda DNA metilasyonu spermatozoanın maturasyonunda son derece önemli bir reaksiyondur.

DNA metilasyonu ne zaman meydana gelir ? Spermatogonial’den spermatosit transisyonu boyunca metilasyonun hem kaybı hem de kazanımı gerçekleşir.

DNA metilasyonu ne zaman meydana gelir ? Bazı testise özgü tek kopya genler (fosfogliserat kinaz-2, transisyon protein 1) spermatogenez boyunca ekspresyonlarında demetile olurlar.

Sperm DNA’sının Metilasyonu Memeli sperm DNA’sının somatik hücrelerden daha az, premayotik germ hücrelerinden daha çok 5-metil-sitozin (metillenmiş DNA), içerdiği rapor edilmiştir.

5’-azasitidin Erkek germ hücresi gelişiminde DNA metilasyonunun etkisi, 5’-azasitidinin spermatogeneze etkisi ile gösterilmiştir.

5’-azasitidin 5’-azasitidinin replikasyon sırasında DNA’ya girer ve DNA metilasyonunu bloke eder. Böylece; - testiste ve epididimiste kondanse olmuş spermatid ve sperm sayısı azalır ve - implantasyon öncesi embriyo gelişiminde anormallikler ortaya çıkar.

DNA Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi İmprinting defektlerinin bozuk spermatogenezden kaynaklanıp kaynaklanmadığı araştırıldığında, orta derece ve ciddi oligozoospermik hastalarda H19 geninin doğru olarak metillenmediği ortaya çıkmıştır. Marques CJ, Carvalho F, Sousa M, Barros A. Genomic imprinting in disruptive spermatogenesis. Lancet 2004 363(9422):1700-2.

H19 Genindeki Hipometilasyonun Etkisi H19 geninin normal şartlarda spermatogenez sırasında premayotik evrede babadan gelen allelinin metilasyona uğrayarak imprinte olması ve bunun da bir supresör geni baskılaması neticesi IGF2’nin eksprese olması gerekir.

H19 Genindeki Hipometilasyonun Etkisi Normalde babadan gelen IGF2 geni bu mekanizma ile eksprese olurken, anneden gelen kromozomdaki IGF2 geni, supresör geni metilasyona uğramadığı için, inhibe durumda kalır. Oysa babaya ait allel yeteri kadar imprinte olamamışsa, yani supresör gen baskılanamamışsa, IGF2 de yeteri kadar eksprese olamayacaktır. Bu durumda hem anneden hem de babadan gelen kromozomlarda IGF2 eksprese olamayacağından, spermatogenez de normal işlemeyecek ve neticede oligozoospermi gelişecektir.

DNA Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Bu çalışmanın sonuçlarına göre, hipospermatogenez ile anormal genomik imprinting ilişkilidir ve oligozoospermik erkeklerin spermleri imprinting hatalarının aktarımı hususunda artmış risk taşırlar. Marques CJ, Carvalho F, Sousa M, Barros A. Genomic imprinting in disruptive spermatogenesis. Lancet 2004 363(9422):1700-2.

DNA Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Paternal genomun metilasyon durumu önemli bir faktördür.

DNA Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Sperm global DNA metilasyonu seviyesinin İn Vitro Fertilizasyon (IVF) başarısı üzerine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada, metilasyonunun fertilizasyon oranlarını etkilemezken, embriyo gelişimini etkilediği (metilasyon belli bir değerin altında ise, embriyo gelişimi bozuluyor) sonucuna varılmıştır. Benchaib M, Braun V, Ressnikof D, Lornage J, Durand P, Niveleau A, Guerin JF. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results. Hum Reprod. 2005 20(3):768-73.

DNA metilasyonu ve embriyogenez İntra Sitoplazmik Sperm İnjeksiyonu (ICSI) ile elde edilen erkek insan embriyoları, gelişimlerinin 4. gününden itibaren dişilere göre belirgin olarak daha çok normal hücre içeren blastosistlerden oluşmuştur. Ancak böyle bir farklılık IVF ile elde edilen embriyolarda gözlenmemiştir. Dumoulin JC, Derhaag JG, Bras M, Van Montfoort AP, Kester AD, Evers JL, Geraedts JP, Coonen E.Growth rate of human preimplantation embryos is sex dependent after ICSI but not after IVF. Hum Reprod. 2005 20(2):484-91.

DNA metilasyonu ve embriyogenez Embriyolar arasındaki cinsiyete bağlı ortaya çıkan bu büyüme farklılığının, ICSI işleminin X-kromozom inaktivasyonunu sağlayan epigenetik olaylarla çatışmasından kaynaklanabileceği hipotez edilmiştir. Dumoulin JC, Derhaag JG, Bras M, Van Montfoort AP, Kester AD, Evers JL, Geraedts JP, Coonen E.Growth rate of human preimplantation embryos is sex dependent after ICSI but not after IVF. Hum Reprod. 2005 20(2):484-91.

İnfertil çiftlerdeki genetik faktörlere ek olarak, çevresel faktörlerin de (hormonlar ve kültür medyumları) implantasyon, plasentasyon, organ oluşumu ve fetal büyümeyi kontrol eden epigenetik süreçlere negatif etkileri olabileceği hakkında günümüzde giderek artan kanıtlar mevcuttur. Tüm bunlara ek olarak, epigenetik kontrolün kaybı, gizlenmiş genetik varyasyonların ortaya cıkmasına neden olabilir.

Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Erkek üreme organlarının gelişimi, spermatogenez ve normal seksüel aktiviteyi kontrol eden genlerin, doğru zamanlarda ifade edilmelerinin yanı sıra doğru miktarlarda ifade edilmelerinin önemi açıktır.

Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Eğer bazı diyetler, ilaçlar veya çevresel kimyasallar DNA metilasyonunu değiştirebilme kapasitesine sahip iseler, bu tür zenobiyotiklerin (organizmaya yabancı maddeler) erkek üreme kapasitesine olan etkilerini araştıran daha fazla çalışmaya gereksinim olduğu bir gerçektir.

Metilasyonu ve spermatogenez ilişkisi Erkek üreme sisteminin gelişiminde ve spermatogenezi etkileyebilen genlerin ifadesinde DNA metilasyonunun rolü, metilasyon bozukluklarının infertilitedeki önemine dikkat çekmektedir.

İlginiz için teşekkürler