MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ Dr. Fahri ŞAHİN Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

MKH ÜRETİMİ ve SORUNLAR

Sorunlar Örnek alımı MNH eldesi Kültüre etme Tripsinizasyon Pasaj Tanımlama / Diferansiyasyon Etik / Yasal sorunlar

Örnek Alımı Kemik İliği Spongioz Kemik Kortikal Kemik

İnkübasyon Nonadheren hücrelerin atılması 48-72 saat inkübasyon Fikol KİA MNH tabakası Plazma Fikol Eritrosit Santrifüj 800g 20 Dak Yıkama 48-72 saat inkübasyon Taze BY Nonadheren hücrelerin atılması İnkübasyon

Tripsinizasyon Tripsin - EDTA 5 dk İnkübasyon

Tripsin blokajı ve yıkama Serum içeren Media veya PBS 800G 10 dk Tekrar kültür ve tripsinizasyon ile 2-6 pasaj

FBS Son yıllara kadar MKH lerin in vitro ekspansiyonu için 10 % FETAL BOVİNE SERUM (FBS) kullanılıyordu Virüs, bakteri, prion bulaşı İmmün veya lokal inflamatuar reaksiyonlar Engrafman yetmezliği, rejeksiyon Otolog serum kullanımını gündeme getirmiştir

Proliferasyon : C > D = B > A %1 OS C D %3 OS %10 FBS %10 OS Proliferasyon : C > D = B > A Osteojenik Dif. : C +++ > D ++ > B + > A 0 Adipojenik Dif. : D +++ > C ++ > B + > A 0 Norbert Stutea et al. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004 (Hamburg, Germany)

Türler arasında farklılık İnsan, sıçan ve tavşanda MKH üretim nispeten kolay Farede üretim oldukça sıkıntılıdır

Farelerin 5-florourasil ile muamelesi CD11b’ ye karşı antikor ile immündeplesyon BY değişikliği: DMEM yerine α-MEM Düşük glukoz içerikli BY

Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü Flowsitometrik değerlendirme CD11b, CD31, CD34 ve CD45 negatif SH2 (CD105), SH3 veya SH4 (CD73), CD117 (c-kit), CD90 (Thy-1) ve STRO-1 pozitif

Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü 2. Diferansiyasyon özelliğinin değerlendirilmesi * Osteojenik diferansiyasyon * Kondrojenik diferansiyasyon * Adipojenik diferansiyasyon

Osteojenik Diferansiyasyon Alkalen fosfataz aktivitesi

Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu Beyaz ok : osteoblastik kolonide ALP border. Siyah ok: Apatit mineralizasyonu (X-ray) Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu von Kossa boyası

Kondrojenik Diferansiyasyon Mikropelet kültürde, Kartilaginöz proteoglikanların pozitifliği. Gümüş mavisi boyası Safranin O boyası

Adipojenik Diferansiyasyon Lipidden zengin vakuollerin intraselüler birikimi Oil-Red O boyası

Good Manufacturing Practice GMP

For Tissue Engineering…… That is not dead which can eternal lie, And with strange aeons even death may die Howard Lovecraft Sonsuzluğa uzanabilen ölüm değildir Ve garip sonsuzluklarda ölüm bile ölebilir This is not the end This is not even the beginning of the end But it is the end of the beginning Winston Churchill