Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Genital Trakttan En İyi Spermi Nasıl Elde Ederim? Matür Sperme Ulaşmayı Sağlayan Faktörler Prof.Dr. Barış ALTAY Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı

Sperm Kaynakları Ejakulat Testis Epididim Vaz deferens 2

Sperm Elde etme Teknikleri Testiküler sperm PercBiopsy Perkütanöz testiküler otomatik tabanca biopsi TEFNA Testiküler ince iğne biyopsi TESE (unifocal, multifocal) Testiküler Sperm Ektraksiyon TESE M-TESE Mikroskopik TESE Krio-TESE TESE kriyoprezervasyon amaçlı Onko-TESE TESE testiküler tümörlü hastalarda Re-TESE Tekrarlayan TESE Post-testiküler sperm PESA Perkütanöz Epididimal Sperm Aspirasyonu MESA Mikroskopik Epididimal Sperm Aspirasyonu VASA Vaz deferens Sperm Aspirasyonu JLU GIESSEN Pantke et al, Eur Urol Suppl 7: 703-714 (2008)

MESA PESA Longitidunal skrotal insizyon Obstrükte epididim dilate ve sedef rengi Epididimal tunika vaginalis insizyonu 27G angiokateter ile sıvı aspire edilir. 1985 yılında Temple-Smith tarafından ilk uygulama İnsizyon gerekmez Lokal anestezi 21G kelebek iğne, 20ml enjektör MESA’ya göre sperm elde etme oranı ve elde edilen sperm miktarı düşük (sperm dondurma için yetersiz örnekleme) Kan hücreleri (makrofaj) ile kontaminasyon sık Yaklaşık %26 başarı 1994 yılında Craft tarafından ilk uygulama Pasqualotto et al. JUrol 2003 4

OA’de sperm kalitesi Epididimal sperm kalitesinde artış iyi iyi Normal Obstrüksiyon Kaput Kauda iyi iyi 5

MESA ile başarı

Vaz Aspirasyonu JLU GIESSEN

Perkütanöz Vazal Sperm Aspirasyonu Anejakülasyon nedeniyle 26 infertil erkekte uygulanan perkütanöz yöntemle vaz deferensten sperm ortalama %78 motilite, sayı 36milyon/cc değerlerle elde edilmiştir. IUI ile 19 hastada %73 oranında hamilelik başarısı bildirilmiştir. Qui et al. Fertility and Sterility 2003

Testiküler Sperm Aspirasyonu .

Testiküler İnce İğne Aspirasyonu = TeFNA

İnce iğne testiküler sperm aspirasyonu Farklı etiyolojilerde toplam 56 hastada (32 varikosel, 16 inmemiş testis, 3 orşi-epididimit, 2 mumps orşit ve 3 torsiyon) yapılan FNA haritalama yöntemi Sperm elde etme oranı %68 (her iki testis için) Herhangi bir patoloji saptanmayan testiste %29 daha fazla sperm elde etme oranı Shefi et al. Reprod Biomed Online 2009

TESE Açık testis biyopsisinden elde edilen sperm ile ICSI uygulaması ilk kez Silber tarafından 1995 yılında bildirilmiştir. Mikroskopik TESE yöntemi ise ilk kez 1999 yılında Schlegel tarafından tanımlanmıştır.

TESE’de Başarıyı Belirleyen Faktörler FSH, T. Testosteron ve inhibin B ile %71sensivite, %71.4 spesifite Tsujimura et al. J Urol 2004 AZFa ve b delesyonları Testis histopatolojisi Testiküler sperm elde etmede kullanılan yöntem

Testis Histopatolojisi Harris et al. Urol Clin N Am 2008

Testiküler Sperm Elde Etme Oranları Obstrüksiyon %100 Testiküler yetmezlik %50-60 Klinefelter %30-50 AZFa / AZFb %0 JLU GIESSEN

AZF Y Kromozon Delesyonları AZFa delesyonları germ hücrelerinin tam olarak yokluğu ve Sertoli hücrelerinin varlığı ile karakterizedir (Sertoli-cell only sendromu) AZFb delesyonları germ hücrelerinin pakiten safhasında gelişimsel duraklaması ile ilişkilidir AZFa-b delesyonları ile yetersiz spermatogenez sıklıkla bildirilmektedir AZFc delesyonları germ hücrelerinin spermatid aşamasında maturasyon duraklaması ve bazen hipospermatogenez ile ilişkilidir

AZF Y Kromozon Delesyonları

Yöntem Harris et al. Urol Clin N Am 2008

İmmatür Hücre-Serbest Oksijen Radikalleri (ROS) İmmatür hücrelerde SOR açısından zengindir ve buna bağlı DNA hasarı matür spermde gelişir. Kaspaz ve endo-nükleaz enzimleri ile direk veya indirek yolla sperm DNA fragmantasyonuna yol açar. Sakkas et al. Fertilty and Sterility 2010

DNA Hasarı Oosit, sitoplazmik ve genomik kalitesine bağlı DNA hasarını tamir etme özelliğine sahiptir. Ancak yaş artışı ile birlikte azalır. Yine embriyodaki DNA hasarı sadece spermatozoa kaynaklı değildir, oosit kaynaklı olanlar da göz ardı edilmemelidir. Sakkas et al. Fertilty and Sterility 2010

DNA Hasarı Mekanizmaları

DNA Hasarı Mekanizmaları Hem mitokondrial hem de nükleer DNA etkilenir. Sperm hücrelerinin üretim veya transport aşamasında bu sorun gelişebilir.

DNA Hasarı Mekanizmaları Spermatogenez sırasında apoptozis Spermiogenez sırasında sperm kromatin yapısı şekillenirken DNA dizisindeki bozulma Seminifer tübül ve epididimden geçiş sırasında oksijen radikalleri ile indüklenmesi sonrası post-testiküler DNA fragmantasyonu Endojen kaspaz ve endonükleazlar ile Radyoterapi veya kemoterapiye bağlı Çevresel toksinlere bağlı

Apoptozis Sertoli hücreler tarafından desteklenecek oranda germ hücrelerinin sayıca sınırlandırılması Anormal yapıdaki spermatozoanın azaltılmasında görev alır Bu sayede artan DNA hasarı veya azalan DNA onarım mekanizmaları sonrası hatalı genetik bilginin embriyoya geçişi engellenir.

DNA Hasarı-Apoptozis DNA fragmantasyonu, özellike sıkça neden olarak gösterilen matürasyon duraklamasına bağlı immatür hücreler nedeniyle apoptozis mekanizmasında rol oynar. Aziz et al. Human Reroduction 2007

Testiküler Spermde DNA Hasarı Daha Düşük Sertoli hücrelerden ayrılan spermatid ve spermatozoa oksidatif stres ve Sertoli hücrelerden salınan nutrisyonel destekten yoksun kalmaya bağlı DNA hasarına maruz kalır. Buna bağlı spermatozoanın destek hücrelerden ayrılma süresi de uzar Bu anafikirden yola çıkarak, DNA hasarının testisten ayrıldıkça artacağını söyleyebiliriz. Tesarik et al. Human Reproduction 2004 Greco et al. Human Reproduction 2005

Sperm DNA Hasarı ve ICSI En az 2 başarısız ejakülattan ICSI uygulaması sonrası18 erkek hastada TUNEL yöntemi ile DNA hasarı tayini Ejakülat sperm DNA hasarı ≥ %15 Ejakülat spermi ile başarısız ICSI siklusu sonrasında testiküler sperm ile ICSI Greco E,et al.Hum Reprod. 2005 27

Sperm DNA Hasarı ve ICSI Ejakulatta sperm Testiküler sperm DNA Hasarı %23.6 % 4.8 Fertilizasyon %70.8 %74.9 Gebelik % 5.6 %44.4 DNA hasarı yüksek olan erkekler için ejakülat spermi ile başarısız ICSI sonrasında testiküler sperm ile ICSI uygulanması düşünülebilir Greco E,et al.Hum Reprod. 2005 28

Sperm DNA Hasarı-ICSI Sperm DNA hasarı-ICSI başarısını Toplam 11 çalışmayı inceleyen metaanaliz çalışma 1549 siklus(808 IVF, 741 ICSI) 640 gebelik (345 IVF,295 ICSI) Sperm DNA hasarı 6 çalışmada SCSA, 5 çalışmada TUNEL ile değerlendirilmiş. Zini A, et al.Hum Reprod.2008 29

Sperm DNA hasarı-ICSI Sperm DNA hasarı ile IVF/ICSI sonrası gebelik kaybı arasında anlamlı ilişki mevcuttur.(p<0.001) Zini A, et al.Hum Reprod.2008 30

Sperm DNA hasarı-ICSI Fertilizasyon ve hamilelik oranlarını etkilemez Lin et al. Fertility and Sterility 2008

Ejakülat-Testis Daha önce DNA hasarı nedeniyle 3 ay oral antioksidan tedavi gören 12 infertil hastada TUNEL ile incelenen DNA hasarı ejakülatta testise göre 3 kat fazla bulunmuştur (%39.7- %13.3). Moskovtsev et al. Fertility and Sterility 2010

Ejakülat-Testis Moskovtsev et al. Fertility and Sterility 2010

Testis-DNA Hasarı Sakkas et al. Fertilty and Sterility 2010

Testis-DNA Hasarı Her ne kadar testiküler sperm, tekrarlayan ICSI başarısızlıklarında DNA hasarı açısından tercih edilse de; Seminifer tübüller epitelinde apoptozise bağlı ve Spermiogenezde kromatinin remodelasyonu sırasında defektlere bağlı testiküler sperme ait DNA hasarı olabilmektedir. Sakkas et al. Fertilty and Sterility 2010

Ejakülatta DNA Hasarlı Spermin Seçilmesi Ejakülatta Tunel testi ile saptanan DNA hasarlı spermleri saptamak için manyetik hücre ayırıcılar Said TM et al. Reprod Biomed Online 2005 Class (Confocal light absorbtionscattering spectroscopy) ile non-invazif subselüler yapıların görüntülenmesi Bartoov et al. Fertil Steril 2003

Sperm RNA fonksiyonları Lalancette et al. J Cell. Biochem 2009

Sperm RNA fonksiyonları Erken dönem embriyo gelişim Nükleer matriks yapıda yer alma Protein translasyonu Paternal genomun oosit için hazırlanması

Matür Sperm ve m-RNA İlişkisi Normal embriyonik gelişim için spermatozal RNA içeriğinin oosit içine taşınması gereklidir. Spermiogenez sırasında histonlar yerini geçici proteinlere ve daha sonra daha küçük yapıda protaminlere bırakarak nükleusu oositin 1/13’ü oranında kompakt hale getitirir. Lalancette et al. J Cell. Biochem 2009

Matür Sperm ve m-RNA ilişkisi Ejakülatta mRNA kimyasal/moleküler yöntemlerle, Steger et al.Hum Reprod 2008 Mikro-array ve PCR ile araştırılarak değerlendirilmektedir. Wang et al. J Mol Med 2004 Spermiogenez sırasında haploid yapıdaki spermatidlerin differansiasyonu ve genetik bilginin aktarılması açısından önemlidir.

Spermatozoal RNA Spermatozoa mRNA, anti-sense RNA ve microRNA’yı oosit içine taşımaktadır Kapasitasyon sırasında sperm orta bölümde yerleşen RNA önem taşımaktadır. Matür sperm içindeki görev tanımı açısından ayrıntılı çalışmalara gereksinim vardır.

Pregnancy Specific ß-1-Glicoprotein Onbir fertil, 33 infertil hastada PCR ile yapılan sperm mRNA analizlerinde PSGI (pregnancy specific ß-1-glicoprotien) ve HLA-E mRNA değerlerinin fertil grupta belirgin şekilde yüksek olduğu gösterilmiştir (p<0.05). PSGI, fetüsün maternal immun sisteme karşı korunmasında ve erken gestasyonda önemli rol oynar Avedano et al. Hum. Reprod. 2009

Matür sperm mRNA’yı oosit içine göndermektedir. Zigotik gelişim sırasında PSGI (pregnancy specific ß-1-glicoprotien) ve HLA-E mRNA mikroenjeksiyon yapılan hamster oositleri içinde gösterilmiştir. Avedano et al. Hum. Reprod. 2009

Protamin İnsan sperm nükleusunda bolca bulunan nükleer proteinlerdir. P1 matür protein, P2 prekürsör olarak 2 farklı tipte tanımlanmaktadır.

Protamin1 / Protamin2 Oranı P1/P2 oranı sperm DNA fragmantasyonu ile yakın ilişkilidir. İnfertil erkeklerde oran belirgin şekilde azalmaktadır. Garcia-Peiro et al. Fertil Steril 2010

Protamin 102 infertil hastada ICSI öncesi yapılan elektroforez ve dansitometri ile sperm protamin analizinde azalan P1/P2 ve pre-P2/P2 oranları ile hamilelik oranlarını düşüklüğü arasında paralellik olduğu gösterilmektedir. de Mateo et al. Fertil Steril 2009

Protamin Azalan P1/P2 oranları spermatozoanın fertilizasyon yeteneğinin azalma göstergesidir, ancak ICSI yöntemi ile sorun aşılabilir. Embriyo transferi sonrası azalan hamilelik oranları ile de ilişkilidir. de Mateo et al. Fertil Steril 2009

Bozulan Spermatogenez PCR ile Protamin TESE öncesi prognostik gösterge Normal spermatogenez Bozulan Spermatogenez Protamine-positive round spermatids Protamine-negative round spermatids TESE + - PCR ile Protamin TESE öncesi prognostik gösterge

Sertoli hücreler İnhibinß Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) Stem cell factor (SCF) tarafından salgılanan faktörlerdir.

GDNF-SCF Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF): Differansiye olmayan spermatogonia’nın farklılaşmasını sağlar Stem cell factor (SCF): Tip A spermatogonia’nın proliferasyonu ve differansiasyonunu sağlar ve spermatogonialar spermatositlere dönüşür.

ICSI amaçlı TESE uygulanan 52 NOA hastada (histopatolojik tanı SCO olarak değerlendirilen) GDNF ve SCF açısından değerlendirmede , sperm elde etme oranlarının GDNF ile boyanmayan ve SCF ile yoğun boyananlarda yüksek olduğu gösterilmiştir. Fujita et al. Human reproduction 2005

İnmemiş Testis-TESE Başarısı Kriptorşidizm toplumda %1, infertil popülasyonda %3-8 ve azospermik erkeklerde %20 oranında gözlenir. Sperm elde etme oranı ise yaklaşık tüm NOA tanılı olgularda olduğu gibi %50 civarındadır. Vernaeve et al. Human Reproduction 2004

İnmemiş Testis-TESE Başarısı Orşiopeksi op. uygulanan 79 NOA tanılı olguda başarıyı öngören parametre rapor edilememiştir. Vernaeve et al. Human Reproduction 2004 Sperm+ Sperm- Orşiopeksi yaşı 10.6 15.5 FSH (IU/l) 24 28 Testoteron (ng/ml) 4.4 3.4 Testis Hacmi (ml) 10 8.5

KF için Prediktif Faktörler Hasta yaşı, testis volümü, FSH, FSH/LH oranı, testosteron düzeyi testiküler sperm varlığı için klinik olarak anlamlı göstergeler değildir En iyi gösterge testiküler histolojide sperm saptanmasıdır

KF’li Hastalarda Başarı Non-mozaik KF’li azospermik hastaların %50-70’inde testiküler sperm bulunabilmektedir 47 XXY spermatogonia mayoza gidebilmekte ve spermatogenez sürecini tamamlayabilmektedir Non-mozaik KF’li hastalarda testiküler histolojide geniş alanlarda Leydig hücreleri ve sklerotik tübüller ile çok küçük alanlarda spermatogenez izlenmektedir

Klinefelter-Testosteron Düzeyi Non-mozaik azoospermik 68 Klinefelter tanılı hastaya toplam 91 mikro-TESE işlemi Serum testosteron düzeyi 300 ng/dl altında olan hastalara testosteron replasmanı Hastaların %66’sında(n=45) sperm(+) Testosteron düzeyi normal olan hastalarda sperm bulma oranı %86 Tedavi ile testosteron düzeyi 100 ng/dl den fazla artan hastalarda %72 100 ng/dl den az artan hastalarda %58(p<0.05) Ramasamy et al. J Urol 2009

Klinefelter-Testosteron Düzeyi Ramasamy et al. J Urol 2009

Sonuç Spermatogenezis daha ileri döneme ulaştıkça, matür sperm elde etme şansımız fazladır. Testis hacmi, FSH, Testosteron ve inhibin B analizi belirleyici faktörler değildir. Testis histolojisi, AZF Y kromozon delesyonu matür sperme ulaşma konusunda yol göstericidir.

Sonuç Epididimal veya testiküler sperm kullanılarak uygulanan ICSI ile fertilizasyon, implantasyon ve gebelik oranları arasında anlamlı farklılık yoktur. Ejakulat sperminde testiküler sperme göre DNA hasarı daha fazladır. Ejakulat sperminde yüksek DNA hasarı olan hastalarda başarısız ICSI sonrası testiküler sperm ile ICSI uygulanabilir.

Sonuç Sperm DNA hasarı ICSI ile elde edilen fertilizasyon ve gebelik oranlarına etki etmez. Sperm DNA hasarı ile ICSI sonrası gebelik kaybı arasında anlamlı ilişki mevcuttur. Sperm nükleusunda yer alan protaminlerin araştırılması matür sperme ulaşmada yol gösterici olma açısından önemlidir.

Sonuç Klinefelter tanılı infertil erkeklerde en iyi gösterge testiküler histolojide sperm saptanmasıdır. Testosteron düzeyi 300ng/dl üzerinde olan KS’li hastalarda TESE ile sperm bulma oranı daha yüksektir.