Tekrarlayan implantasyon başarısızlığında sperm faktörünün yeri Dr. Engin Enginsu, Ph.D. III. ÜREME TIBBI DERNEĞİ KONGRESİ 2011

Sperm Seçimi Neden Gerekli IVF uygulamalarının ilk yıllarında sperm ayrıştırma yapılmıyordu Sperm seçimi Motil sperm Normal morfolojik sperm Testiküler dokudan sperm ekstraksiyonu Kromatin yapısı normal sperm… Fertilizasyon’dan sağlıklı çocuk doğumuna kadar etkili Tüm ART uygulamalarında fizyolojik inseminasyon hedeflenmeli

Semen Analizi En az iki spermiogram Ejakülat hacmi 1.5’ten 5.0 mL’ye Sperm sayısı >15 milyon/mL WHO 2010 Hareket >%30 Progresif hareket >%30 Morfoloji >%4 normal (MEUSC) Ve: Aglütinasyon yok Piyospermi yok Viskosite normal

Sperm Anomali Oranı n=1776 SPERMED Laboratuvarı 2006

Morfoloji Baş Düzgün kontür oval Akrozom %40-%70 Ekvatorial segment konturlara uygun Boyun Kuyruk Değerlendirme 10x100 büyütmede 1: Kruger TF, et al. Fertil Steril. 1988; 49(1):112-7. 2: Kruger TF, et al., Urology. 1987 ;30(3):248-51.

Morfoloji Semen analizi ile OPU günü arasındaki zaman morfolojiyi etkilemiyor (Sukcharoen N. Hum Rep’96) Strict Kriterler ile değerlendirildiğinde Fertil popülasyon cut-off %12 (Günalp S. Hum Rep’2001)

İzole Teratozoospermi Total globozoospermi Makrosefal sperm Total pinhead IUI-D Uzun baş Varikosel İzole teratozoospermi IUI a engel değil

Makrosefal Sperm ve PGD This result shows statistical significance (Kahraman et al.RBM Online, 2004)

Makrosefal Sperm (Kahraman et al.RBM Online, 2004)

Globozoospermi Üst sol resim:tunnel test,globolarda yüksek oranda DNA fragmantasyonu tunnel ile ortaya konmuştur.parlak yeşil olanlar apoptotik,mat yeşil olan normal sperm nüklear yapısı gösterir. Alt sol resim: transmission elektromikroskopi,contain abundant , disorganized cytoplasm in the head , circular ,condensed and multiple vacualed nuclear structure,and irregular disarrement of mitochondries. Sağ üst :acridine orange,immature nüclear structure seen there by florance staining tech. Sağ alt:sperm fish,(anıla sorulacak)

Globozoospermi Globozoospermi kromatinlerin sferik yapılanması ve akrozomal yapının tümüyle olmaması ile karakterize bir sendromdur. DNA yapısı bilinmiyor Sperm anöploidi oranında artış (vaka sunumu) (Carrell et al. 1999 - 2001) Anormal kromatin yapısı DNA zincir kırıkları (Calogero et al. 2002) Morfolojik değerlendirme ile tanı konur

Sperm Sentriol Bozuklukları Sperm sentriolü fertilizasyon ile oosite girer, duplike olur ve sperm asterini oluşturur Sentriol bozuklukları Embryonik gelişme bozuklukları İmplantasyon başarısızlıkları Abortus(Van Blerkom, 1996) (Rawe et al., 2002) Consequently, any defect of sperm centriole can result in developmental arrest (Van Blerkom, 1996),implantation failure or preclinical abortion (Rawe et al., 2002)

Yüksek magnifikasyonda sperm seçimi IMSI Gebelik 52.6 versus 18.4% İmplantasyon 25.0±25.9 versus 5.9±12.9% Berkovitz et al. 2003, Hum Rep

Tekrarlayan IVF Başarısızlıklarında IMSI Hazout a. 2006, RBM Online

Sperm DNA Hasarı Spermatogenez sırasında oluşan kromatin kondanzasyon bozuklukları Spermatogenez ya da üreme sistemindeki yollarda meydanagelebilecek apopitozis ROS nedeniyle oluşabilecek oksidatif stres

Sperm DNA Hasarı Fetal mutasyonlar ve doğacak bebekte kanser riski Kötü embryo gelişimi İmplantasyonu azaltır Düşük gebelik oranları Tekrarlayan gebelik kayıpları Reviewed in Chohan, et al., J Androl 27: 53-59, 2006

Sperm DNA Hasarı Tanısal Testler COMET Assay Halosperm TUNEL Chromomycin A3 Test DNA Breakage Detection-FISH Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)

Comet Assay Agaroz üzerine yayılan spermlerde hücre elektroforezi DNA migrasyonu değerlendirilir ANORMAL NORMAL Comparison of patient with DNA damage and a fertile male The incidence of DNA damage in infertile men is higher than fertile men Real-time modified alkaline SCGE assay showing fluorescent DNA unraveling from damaged sperm nucleus and forming comet tail. Am J Obstet Gynecol. 2001;184:1068

Halosperm DNA kırıklarının saptanması- FISH Asit ile denatürasyon ve nüklear proteinlerin çıkmasından sonra halo değerlendirilmesi

TUNEL Test DNA kırıklarındaki tek ve çift sarmal kırıkların saptanması TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) DNA kırıklarını araştırmaları için kullanılan en yaygın yöntem

TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin Nick End Labelling NORMAL KROMATİN APOPTOTİK KROMATİN

Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) Acridine Orange Test Floresan mikroskop Flow cytometry Yeşil normal, kırmızı DNA kırıkları DNA Kırıkları = Kırmızı/Kırmızı + Yeşil İleri teknoloji malzeme gerekmekte

DFI, HDS Lin et.al. Fert. Ster. 2008

DFI, HDS Kennedy et. al. RBM Online 2011

Hyalüronik Asit (HA): Fizyolojik Sperm Seçimi PH-20 proteini Hyalüronidaz dan farklı bir bağlanma bölgesine sahiptir (Gmaachl & Kreil, 93, Gacesa et al., 94) Sperm – Oosit Bağlanmasının Değerlendirilmesi Matür Sperm Normal Morfolojik Sperm (Kruger) Kromatin Yapısı Normal Sperm HBA ile IUI veya ICSI seçimi Gmaachl & Kreil, 93, Gacesa et al., 94

Hyaluron Binding Assay - HBA Olgun Sperm Anöploidi düşük Yüksek Fertilizasyon OranıO

Hyaluron Binding Assay - HBA

HBA Sonuçlarının Değerlendirilmesi >65% bound = good quality sperm Traditional IUI or IVF <65% bound = “low binders” 20% of infertile couples ICSI using PICSI or SpermSlow

Hyalüronik Asit (HA): Fizyolojik Sperm Seçimi Parmegianni L et al. 2009 JARG

Sperm Seçimi: Teknikler Yıkama Swim – up Swim – out Testiküler spermin hazırlanması Gradient IMSI HA bağlı sperm

Sonuçlar İnseminasyon türü ne olursa olsun sperm seçimi ART başarısını etkileyen en önemli faktördür Sperm morfolojisi ve DNA bütünlüğü sağlıklı canlı doğumlarda önemli etkendir Sperm yıkama teknikleri standardize edilmelidir IMSI ve HA kullanımı ile fizyolojik ICSI hedeflenmelidir