PREİMPLANTASYON GENETİK TANI Hazırlayan: E. Sacide ÇAĞLAYAN

Genetik Bir Hastalık İçin Risk Taşıyan Çift Noninvazif Prenatal Tanı *Ultrasonografi,İTT, ÜTT, Maternal AFP Testi İnvazif Prenatal Tanı *CVS, Amniyosentez, Kordosentez, Preimplantasyon Genetik Test Sistemleri (PGT) *Prenatal genetik tanı (PGD), Prenatal genetik tarama (PGS)

PGT, genetik açıdan hastalıklı çocuk sahibi olma riski çok yüksek aileler için konvansiyonel prenatal tanı yöntemlerinden daha avantajlı bir uygulamadır. Gebelik öncesinde, yardımcı üreme teknikleri ile elde edilen embriyoların genetik analizinin yapılması esasına dayanır.

PGT PGD: Başvuran çift etkilenmiştir (kendisinde ve ailesinde genetik hastalık bulunur) *PCR, FISH,CGH PGS: Başvuran çift etkilenmemiştir *FISH

Tarihçe 1968 yılında, Edwards ve Gardner, ilk ebriyo biyopsisini tavşanlar üzerinde denemiştir. İnsanlarda, ilk PGD denemesi 80’li yılların ortalarında, prenatal tanı yöntemlerine alternatif olarak geliştirilmiştir. Başlangıçta, PGD, X’e bağlı kalıtımı önlemek için cinsiyet belirlenmesi ile ilgilenmiştir. 1989’da Handyside ve ekibinin uyguladığı, X’e bağlı kalıtılan bir hastalık için ilk PGD denemesi ile sağlıklı bir doğum gerçekleştirilmiştir.

2006 yılına kadar,15.000’den fazla PGD uygulaması rapor edilmiştir. Günümüzde PGD ile, bir çok genetik mutasyon belirlenebilmektedir. PGD, günümüzde sağlam bir şekilde uygulanabilmektedir ancak PGS hala yeni, yavaş yavaş gelişen ve tartışılan bir yöntemdir.

PGD’nin Önemi Genetik bir hastalığı kalıtma riski çok yüksek olan çiftlere uygulanır. Sadece etkilenmemiş ve sağlıklı embriyoların uterusa transferi yapıldığından erken veya geç dönemde yaşanan abortus veya gebeliğin sonlandırılması gibi travmatik durumlar önlenmektedir.

PGD 3 temel hastalık grubu için önerilmektedir. 1) Cinsiyete bağlı kalıtılan hastalıklar 2) Tek gen hastalıkları 3) Kromozomal Düzensizlikler Günümüzde multifaktöriyel hastalıklara ve nonmendeliyen hastalıklara yönelik PGD uygulamaları de yapılabilmektedir

Cinsiyete Bağlı Kalıtılan Hastalıklar X’e bağlı kalıtılan hastalıkların bir sonraki nesle aktarılmasından taşıyıcı bir anne sorumludur. Taşıyıcı anne, anormal X kromozomunu erkek çocuğuna aktardığında hastalık ortaya çıkar, çünkü babadaki normal X’in geçişi olmaz. Etkilenmiş babanın erkek çocuklarının tamamı normal olurken, kız çocukları taşıyıcı olur. Hemofili, frajil X ve birçok musküler distrofi (resesif) Rett sendromu ve psödohiperparatiroidizm (dominant)

Tek Gen Hastalıkları Bu tip hastalıkların tanımlanmasında, PCR temelli moleküler teknikler uygulanmaktadır. En önemli sorunlardan biri çok sayıda mutasyon içeren hastalıkların analizinde yaşanmaktadır. Birçok nadir mutasyon rutin olarak çalışılamamkta ve klinik belirtisi olmayan bir çiftin taşıyıcı olma riski bulunmaktadır Kistik Fibroz (CF), Tay-Sachs, Orak Hücre Anemisi ve Huntington BRCA-1 (spesifik bir hastalık nedeni değil ancak bir grup hastalık için risk artışına yol açan mutasyonlar)

PGT – Tek gen hastalıları OTOZOMAL RESESSİF Kistik fibrozsis (various mutations) Tay Sachs hastalığı -talassaemi Orak hüreli anemi Rh grubu tayini Spinal müsküler atrofi Adrenogenital sendrom Konjential adrenal hiperplazi Epidermolizis bülloza Gaucher hastalığı Fanconi anemisi HLA uyumu Üçlü tekrar hastalıkları Frajile X Miyotonik distrofi Huntington hastalığı OTOZOMAL DOMINANT Marfan sendromu Charcot-Marie Tooth hastalığı (type 1A) Crouzons sendromu NF2 Osteogenesis impeerfekta I and IV Stickler sendromu Tuberoz skleroz Familyal adenomatöz polypozis koli Li Fraumeni sendromu Retinoblastoma X’e bağlı Lesch Nyhan sendromu Duchenne kas distrofisi Charcot-Marie Tooth hastalığı Retinitis pigmentoza Ornitin Transkarbamilaz Hemofili Agammaglobulinemi Alport sendromu Hunter sendromu MPSII Oro-facial-digital sendrom tip I

Kromozomal Düzensizlikler Translokasyon, delesyon, insersiyon gibi yapısal düzensizlikler Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH) tekniği ile belirli bir lokusa spesifik, telomerik problar kullanılarak belirlenmektedir Bazı çiftler, PGD uygulanmadan, kendiliğinden oluşan bir gebelikle çocuk sahibi olamamaktadır, çünkü önceki konsepsiyonlarda dengesiz kromozomal düzensizlik spontan düşüklere yol açmaktadır.

PGS ve Endikasyonları Yüksek risk taşıyan hastalarda anöploidi taramaları amacıyla yapılır. PGS için gerekli endikasyonlar: İleri maternal yaş Tekrarlayan gebelik kaybı öyküsü Tekrarlayan IVF başarısızlığı İnfertilitede erkeğe bağlı faktörler

PGS Embriyoda anöploidi riski, anne 35-39 yaş arasında ise %20’den daha yüksekken, 40 yaş ve üzerinde yaklaşık %40 civarındadır. Bu tip olguların birçoğu, gebelikten kuşkulanmadan önce kaybedildiği için fark edilememektedir PGS uygulaması ile sağlıklı gebelik oluşma ihtimali artarken, düşük veya etkilenmiş embriyo oluşumu riski düşmektedir.

PGD ve Cinsiyet Belirlenmesi Kültürel, etnik, sosyal ve psikolojik nedenlerden dolayı, bazı durumlarda arzu edilen cinsiyette çocuk sahibi olmak için PGD’den yardım almayı taleb eden çiftler olabilmektedir. Bu tip uygulamalara yaklaşım toplumdan topluma değişebilmekle birlikte hala yoğun olarak tartışılmaktadır.

PGT’nin AŞAMALARI 1) IVF 2) TEK HÜCRE BİYOPSİSİ 3) GENETİK TESTLER 4) EMBRİYO TRANSFERİ

IVF Ovaryan Stimulasyon Foliküler Aspirasyon Maturasyon İçin Bekleme İntrasitoplazmik Sperm İnjeksiyonu (ICSI) Fertilizasyon Sonrası Embriyonik Gelişim İçin Kültür Süreci

TEK HÜCRE BİYOPSİSİ Polar body biyopsisi Yarıklanma aşamasında embriyo biyopsisi Blastosit biyopsisi

İnsan Oositi Hazırlanmış Sperm İlk gün İnsan Oositi Hazırlanmış Sperm

Intrasitoplazmik Sperm Injeksiyonu (ICSI)

2. gün 2 hücreli embriyo 4 hücreli embriyo

3. Gün 8 hücreli embriyo (72 saat) Yarıklanma aşamasında biyopsi (blastomerler)

5/6. günler Blastosist Biyopsi ?

Blastomer biyopsisi (3.gün) Kutup cismi biyopsisi

PGD’DE KULLANILAN GENETİK TESTLER PCR FISH CGH

PCR (DNA Amplifikasyonu) Genellikle, dominant veya resesif hastalıkları kapsayan tek gen defektlerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. DNA molekülü, nükleotid bazlara ve primere tutunmayan DNA polimeraz enzimi içeren bir solusyonla muamele edilir. Yüksek ısıda DNA iplikleri arasındaki bağlar yıkılır. Isı düşürüldüğünde, DNA polimeraz serbest nükleotid bazları primere bağlayarak hızlı bir şekilde yeni iplikler sentezler. İki primer arasındaki boşluğun tamamlanması ile yeni bir iplik sentezlenmiş olur. Bu işlemin defalarca tekrarlanması ile, birkaç saat içinde DNA’nın küçük bir kısmının milyarlarca kopyası oluşturulmaktadır.

Bu yöntem bir çok PGT protokolünde yer almaktadır. Burada, yeterli miktarda ve yüksek kalitede saf DNA molekülü elde etmek gerekir ve bazı durumlarda polar body ve blastomer gibi tek bir hücrede bunu gerçekleştirebilme hususunda güçlükler yaşanabilir Allelik dropout ve laboratuvar kontaminasyonu da yaşanabilecek önemli komplikasyonlardır. PGD’de tek bir hücre amplifiye edilmelidir. ICSI işleminde maternal ve paternal kaynaklı kontaminasyonun mümkün olduğunca önlenmesi gerekmektedir.

PCR’dan kaynaklanan hatalar, etkilenmiş bir embriyonun transferi veya normal bir embriyonun fark edilememesine neden olabilir (Ör: allelik dropout). Otozomal dominant hastalıklarda etkilenmiş bir embriyonun transfer riski %11, resesif hastalıklarda ise %2’dir.

PGD’de PCR Uygulamaları: Otozomal hastalıklarda tek gen defektlerinin belirlenmesi Erkek infertilitesinde tek gen defektlerinin belirlenmesinde X’e bağlı hastalıklarda cinsiyet tayininde

FISH Özellikle, X’e bağlı kalıtılan hastalıklarda cinsiyet tayini, kromozomal düzensizlikler ve anöploidi taramalarında kullanılmaktadır. Anöploidi taramalarında sağladığı kolaylık nedeniyle PGS’de daha yaygın kullanılır. Bu işelmde, incelenecek kromozomla eşleşmek üzere prob (her prob farklı boya ile işaretli) adı verilen küçük DNA molekülleri kullanılmaktadır. Floresans mikroskobu ile yapılan inceleme sonucu her kromozom renklere göre ayırdedilir. Analiz edilebilecek kromozomlar 13,16,18, 21, (22),X ve Y’dir.

FISH Yöntemi ►Denatürasyon. 730 C 5 dakika ►Hibridizasyon FISH Yöntemi ►Denatürasyon . 730 C 5 dakika ►Hibridizasyon . 370 C 3 saat ►Hibridizasyon sonrası yıkama . 2 dakika 0.4XSSC ►Analiz

Hangi kromozomlar analiz ediliyor? X, Y, 13, 18, 21 13, 16, 18, 21, 22

18 16 18 21 13 22 13 21 16 22 NORMAL FISH

Trizomi 13 (Blastomer nükleusu)

CGH Embriyo nükleusu floresans bir boya ile işaretlenirken, bir kontrol hücresi farklı bir boya (genellikle yeşil) ile işaretlenir. İki hücrenin daha sonra kontrol metafaz plağında kohibridizasyonu gerçekleşir. İki renk yoğunluğu arasındaki fark karşılaştırılır. Kırmızı renk fazla ise embriyo nükleusu ekstra kromozom içermekte, yeşil yoğunluğu fazla ise embriyoda eksik kromozom bulunmaktadır. Bu teknik yaklaşık 72 saati almaktadır.

PGD UYGULAMALARINDA DİKKAT EDİLECEK HUSUSLAR İnfertilite problemi olmayan hastalar IVF için yönlendirilir ve IVF tedavisi ile ilişkili riskler hakkında bilgilendirilir. Hastalara, PGD için yapılacak IVF işlemi hakkında genetik danışma mutlaka verilmelidir, ilgili kalıtım paternleri ve hastalığın etkilenmiş çocuk ve aile üzerindeki olası etkileri detaylı olarak anlatılmalıdır. PGD veya PGS uygulaması yapılacak olsa bile hastalara prenatal tanı (amniyosentez, CVS, kordosentez) hakkında mutlaka bilgi verilmelidir. Donör gametlerinin kullanılması gibi alternatif tedavi stratejileri de tartışılmalıdır. Başarılı bir IVF ve PGD gerçekleşse bile transferden sonra gebelik, zamanında veya erken doğum garanti edilmez.

Hücrenin zedelenmeden veya ciddi bir hasara uğramadan alınması işlemi teknik olarak oldukça zordur, beceri ve deneyim gerektirmektedir. Embriyonun kazaya bağlı olarak yaklaşık %0.1 oranaında hasar görme riski bulunmaktadır Yeni bir hastalığa yönelik tanısal metodoloji zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir. Tek bir hücrenin analiz ediliyor olması bazı sınırlamaları da beraberinde getirir. Eğer embriyoda farklı hücre hatları bir arada bulunuyorsa mozaisizm belirlenemez. Bu sebeple, özellikle amniyosentez gibi prenatal tanı testleri ile sonuç doğrulanmalıdır. Bazı durumlarda, çok sayıda yumurta hücresi veya embriyo anormal olarak belirlenebilir. Bu sebeple az sayıda embriyo transfer edilebilir veya embriyo transferi mümkün olmaz.

Anöploidi taramalarında, PGD ile tüm kromozomlar veya tüm anomaliler tanımlanamamaktadır. Çünkü bir test protokolünde, bir uygulamada sınırlı sayıda kromozom analiz edilebilir. Günümüzde, bir hücre biyopsisinde tek tip genetik araştırma uygulanabilmektedir. Çok sayıda genetik araştırmanın aynı anda yapılması mümkün değildir. Kistik fibroz gibi çok sayıda mutasyonun görüldüğü tek gen hastalıklarında PGD, ikna edici olmayabilir. Bu durumda çiftlere yeni probların oluşturulmasını gerektiren spesifik testler uygulanmalıdır . Yeni probların üretilme süreci birkaç haftayı almaktadır.

PGT’de olası yanlış tanı nedenleri Çözüm: Prenatal Tanı PCR Allel dropout Kontaminasyon sperm/kumulus/DNA/hücreler Mozaiklik FISH Kumulus hücreleri

PGS UYGULAMALARINDA DİKKAT EDİLECEK HUSUSLAR “ PGS günümüzde hala tartışılan bir yöntemdir. Başlangıçta maternal yaşa bağlı risk artışında embriyoda anöploidiyi önlemek için umut verici bir gelişme olarak kabul edilse de, son çalışmalar belirli populasyonlarda başarının sınırlı olduğunu göstermiştir.

Tekniksel Sınırlılıklar: Günümüzde, FISH yöntemi ile 9-11 kromozom analizi mümkündür. CGH ve FISH ile yapılan çalışmalarda, embriyodaki anöploidi %25 oranında belirlenir ve normal olarak tanımlanır, anormal kromozomlar belirlenmez. Analiz edilen hücrelerin yaklaşık %10’una sonuç verilemez veya tereddüt yaşanır.

Tek Hücre Analizinin Sınırlılıkları: Nondisjunction mayoz esnasında oluşmuşsa, embriyoya ait tüm hücrelerde anöploidi görülür. Ancak, mitoz esnasında oluşmuşsa, embriyoda iki veya daha fazla hücre hattı bulunabilir. Tek hücre biyopsisi, embriyodaki mozaisizmin belirlenmesinde yeterli değildir.

Self-Correction: Mozaik bir embriyonun, anormal hücrelerin proliferasyonunu durdurabilme özelliği sonucu, anöploidi tanımlanmış çoğu embriyonun hayatta kalarak, yeniden analiz edildiğinde normal olarak belirlendiğini gösteren kanıtlar mevcuttur.

İleri maternal yaş nedeniyle uygulanan PGS’den alınan sonuçlar değişkendir. Tekrarlayan gebelik kaybı görülen dengeli translokasyon taşıyıcıları da PGS’den yararlanabilmektedir.

SART (Society of Assisted Reproductive Technology) and ASRM (American Society of Reproductive Medicine) mevcut yayınların, PGS ile ileri yaş gebeliği, tekrarlayan gebelik kaybı ve implantasyon başarısızlığında canlı doğum şansını yükseldiğini desteklemediğini belirtmişlerdir ve PGS sonuçlarına dayanarak tedavi seçeneğinin belirlenmesini tavsiye etmemektedir.

PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF işlemi neticesinde doğan bebeklerde fetal malformasyon ve diğer problemlerde artış olduğunu gösteren bir yayına rastlanmamaktadır. Ancak yaşamın ilerleyen dönemlerinde PGD veya PGS prosedürünün (biyopsi) bir sonucu olarak diğer anomalilerin görülmesi olasılığı bulunmaktadır.

PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF işlemi için başvuru oranı, transfer edilen embriyo sayısının azalması nedeniyle PGD ve PGS olmadan uygulanan IVF başvuru oranına göre daha düşüktür.

AVANTAJLAR Gebeliğin geç dönemlerinde, abortus veya gebeliği sonlandırma gibi zor bir seçimle karşılaşma durumunu ortadan kaldırır. Genetik bir hastalığın taşıyıcısı olduğunu bilen ve çocuk sahibi olmayı düşünmeyen çiftler için yeni bir umuttur. Günümüze kadar, PGD veya PGS ile çok sayıda bebek dünyaya gelmiş ve fetal malformasyon veya diğer tanımlanabilir problemlerde bir artış görülmemiştir.

GELECEKTE İnsanda ilk başarılı PGD denemesi 1988’de uygulanmıştır, ancak yöntemin gelişmesi ve kabul görmesi, tek hücre biyopsisinin geliştirilmesinin zaman alması ve maliyeti nedeniyle yavaş olmuştur. PGD yeni bir uygulamadır ve hala yöntemin gelişmesi için birçok çalışma devam etmektedir. Fakat PGD’nin kapsamlı, kabul gören ve yaygın uygulanan bir yöntem olması için çok daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. PGD veya PGS uygulamalarının sınırlandırılmasının gerekliliği önemle vurgulanmaktadır.

Gelecekte, diabet, hipertansiyon, kardiyovasküler hastalıklar, endometriyum kanseri gibi hastalıkların genetik ilişkisi daha iyi anlaşılacaktır. PGD uygulamalarıyla bu hastalıkların kalıtımının önlenmesi mümkün olacaktır. PGS’nin IVF için başvuran hastalara uygulanması hala tartışılan bir durum olsa da önemi, sağladığı fayda ve sonuçları nedeniyle üreme teknolojisinde hala çekici bir yöntemdir. Bunun yanı sıra, belki de gelecekte PGS ile ilgili daha çok tartışma ve etik kaygı gündeme gelebilecektir

KAYNAKLAR Dayal MB, Zarek SM. Preimplantation genetic diagnosis. 2008 Black, S.H. Preimplantation genetic diagnosis. Current Opinions in Pediatrics 1994: 6, 712-716. Harper, J.C., Handyside A.H. The current status of preimplantation genetic diagnosis. Curr Obstet Gynecol 1994: 4, 143-149. Schulman JH, Black SH. Preimplantation Genetic Testing for Huntington Disease and Certain Other Dominantly İnherited Disorders. Clinical Genetics 1996

TEŞEKKÜRLER