Sperm morfoloji değerlendirmesi XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sperm morfoloji değerlendirmesi Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen Analizi Kursu

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sunum Planı Giriş Sperm morfolojisinin tanısal önemi Boyama yöntemleri Değerlendirme Örnek slaytlar

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sperm morfolojisi Leeuwenhoek;1677 Sperm ile ilgili ilk çizimsel tanımlama MacLeod J;1952 İlk kez normal sperm morfolojisini tanımladı. Freund M;1966 Normal ve anormal sperm morfolojisi farklılıklarını tanımladı. Eliasson R;1971 Sperm boyutlarının spesifik ölçümlerini verdi.

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sperm morfolojisi Kruger TF; 1986 Sperm morfolojisinin fertilitedeki prognostik değeri üzerine ilk yorumları yaptılar. Kruger TF;1987 Bilinen sperm morfoloji kriterleri üzerine yeni kriterler eklediler. Kruger; 1988 Sperm morfolojisinin IVF başarısı üzerindeki etkilerini yayınladılar.

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Normal sperm morfolojisi fertilizasyon oranı için mükemmel bir belirleyicidir. Normal morfolojili sperm oranı IVF de gebelik oranı ile ilişkilidir 1. Baş defekti olan spermler, normal olanlara göre hareketsiz olma veya daha yavaş hareket etme eğilimindedirler 2 1Kruger et al, 1996; Morgenthaler et al, 1995 2Aitken et al, 1995; Fertil Steril 1999;72:124-128.

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Normal morfoloji Fertilizasyon oranı <%4 %7.6 %4-14 %63.9 >%14 %88,3

IVF’de sperm morfolojisinin prediktif değeri XII.Ulusal Biyokimya kongresi IVF’de sperm morfolojisinin prediktif değeri Fertilizasyon Oranı Normal Form < % 14 Normal Form > % 14 Oosit Başına % % 49.4 % 88.3 Klivaj Oranı % % 47.5 % 87.0 Kruger et al; 1996 %0-20 sperm oranında zayıf fertilizasyon gösteren olguların %75’inde tek veya çogul sperm defekti vardır Liu & Baker;1994

Sperm boyama yöntemleri XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sperm boyama yöntemleri Boyama yöntemi olarak Papanicolaou Shorr Diff-Quick SpermMac bilinen yöntemlerdir.

Yaymanın hazırlanması XII.Ulusal Biyokimya kongresi Yaymanın hazırlanması Semen numunesi karıştırılır. Numunedeki sperm konsantrasyonuna göre 5-10 µl numune lam üzerine alınır.45 derecelik açı ile en az iki yayma yapılır. Yayma,havada 20 dakika kurutulur ve boyanır.

Diff-Quick boyama yöntemi XII.Ulusal Biyokimya kongresi Diff-Quick boyama yöntemi 1- Numunenin yayılıp kurutulduğu lam, koplin jar içindeki fiksatifte (Metil alkol içinde Tri-methane boyası) 15 sn tutulur. 2-Solüsyon 1 (Xanthene Dye) içinde 10 sn tutulur. 3-Solüsyon 2 (Azine A ve Methylene Blue) içinde 5 sn tutulur. 4-Preparat çeşme suyu ile yıkanır.

Papanicolaou yöntemi Immerse slides in 95% (v/v) ethanol for at least 15 minutes. Sequentially immerse the slides in: 1. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds 2. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds 3. Purified water 30 seconds 4. Harris’s haematoxylin 4 minutes 5. Purified water 30 seconds 6. Acidic ethanol 4–8 dips* 7. Running cold tap water 5 minutes 8. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds 9. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds 10. Ethanol 95% (v/v) At least 15 minutes 11. G-6 orange stain 1 minute 12. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds 13. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds 14. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds 15. EA-50 green stain 1 minute 16. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds 17. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds 18. Ethanol 100% 15 seconds 19. Ethanol 100% 15 seconds

Spermac boyama yöntemi XII.Ulusal Biyokimya kongresi Spermac boyama yöntemi 1-Fiksatifte preparat 15 dk tutulur. 2-8-10 kez suya batırılır yıkanır ve lam ucundan kurutma kağıdına bastırılarak suyu alınır. 3-A solüsyonunda 90 saniye tutulur. 4-Yıkama tekrarlanır. 5-B solüsyonunda 90 saniye tutulur. 6-Yıkama tekrarlanır. 7-C solüsyonunda 90 saniye beklenir. 8-Yıkama tekrarlanır.

Boyama yöntemlerinin karşılaştırılması XII.Ulusal Biyokimya kongresi Boyama yöntemlerinin karşılaştırılması Papanicolau boyama kalitesi daha yüksektir ucuzdur Diff Quik hızlıdır spermler küçülmezler zemin fazla boya alır

Yaymanın değerlendirilmesi XII.Ulusal Biyokimya kongresi Yaymanın değerlendirilmesi Kuruduktan sonra Değerlendirme immersiyon yağı ve objektifi ile 100X büyütmede yapılır. Numunede en az 200 boyanmış sperm sayılır. Baş,boyun ve kuyruktaki şekil değişiklikleri Kruger Strict morfoloji kriterlerine göre sınıflandırılır.

Yaymanın değerlendirilmesi XII.Ulusal Biyokimya kongresi Yaymanın değerlendirilmesi Normal, baş, mid-piece ve kuyruk anomalileri olmak üzere rapor edilir.%4 ve üstü normal olarak kabul edilir. Sperm boyut ve şekillerindeki geniş varyasyonlardan dolayı değerlendirme subjektiftir.

Kruger Strict morfoloji kriterleri XII.Ulusal Biyokimya kongresi Kruger Strict morfoloji kriterleri Normal sperm için baş oval ve düzgün olmalı,akrozom başın %40- 70’ini kapsamalıdır. Boyun,mid-piece ve kuyrukta anomali olmamalıdır. Stoplazmik droplet baş boyutunun yarısından fazla olmamalıdır.

Normal spermin boyutları XII.Ulusal Biyokimya kongresi Normal spermin boyutları

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Baş anomalileri Şekil değişiklikleri Boyut değişiklikleri Vakuoller Akrozom azlığı Akrozom yokluğu Çift başlı

Baş anomalileri Normal Sitoplazmik İnkomplet Spermatid Duplikasyon Droplet Seperasyonu

Baş anomalileri Normal Nükleus Büyük Küçük Vakuolü Nükleus Nükleus

Baş anomalileri Normal Piriform Yuvarlak Elonge Diadem Baş Baş Defekti

Mid-Piece anomalileri XII.Ulusal Biyokimya kongresi Mid-Piece anomalileri Düzensiz şekil Bükülmüş İnce Kalın Bükülmüş kuyruk bağlantısı Kuyruksuz baş

Mid-Piece anomalileri Normal Sitoplazmik Kinked Bend Droplet Mid-piece Mid-piece

Mid-Piece anomalileri Normal Mitokondrial Mitokondrial Pseudodroplet Kopuk Komplet Segmental Baş Aplazi Aplazi

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Kuyruk anomalileri Birden fazla Kangal şeklinde Kırılmış Kısa Terminal droplet

Kuyruk anomalileri Dag Coiled Duplikasyon Defekti Tail

Amorf sperm formları Anomali Form Seperasyon (Adezyon) Normal Multipl Sınıflandırılamayan İnkomplet Anomali Form Seperasyon (Adezyon)

İmmatür sperm formları İmmatür Germ Hücreleri Prekürsör Hücreler (Spermatid)

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Örnekler

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Örnekler Sadece 7 normal…

XII.Ulusal Biyokimya kongresi 1,2,4 normal

XII.Ulusal Biyokimya kongresi 17 normal,18 normal

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Teşekkür ederim…