HİSTOLOJİYE GİRİŞ - MİKROSKOP ve MİKROSKOPİK TEKNİKLER Prof.Dr. Ali OTLU

SEVGİLİ ÖĞRENCİ ARKADAŞLARIM İnönü üniversitesi Tıp fakültesi 1988-1989 Eğitim Öğretim yılında eğitime başlamıştır. Fakültemiz yaklaşık 13 yıl geçici binalarda eğitim verdikten sonra 2000/2001 Ders yılının 2. yarıyılından itibaren yeni binasında eğitim hizmetlerine devam etmektedir. Son yıllarda, Eğitim Öğretim hizmetlerinin daha da iyileştirilmesi yönünde yeni adımlar atılmış, anfi sistemine geçilmiştir.

Sevgili Arkadaşlarım; Bir öğrenci, Tıp Fakültesine kayıt yaptırdığı andan itibaren Tıp Mesleğine girmiştir. Artık gelecekte insanlara etkin, geçerli ve uygun tıbbi hizmet verme kaygı ve sorumluluğu ile karşı karşıyadır. Okulu bitirinceye kadar ve mezun olduktan sonrada tek amacı budur. Bu yönüyle Tıp mesleği; asaletli, itibarlı ve şerefli bir meslektir.

Hekimlere insanların iyiliği ve sağlığı emanet edilmiştir. Sizler bu emaneti yaşamınız boyunca korumak ve kollamakla yükümlüsünüz. Aranızda, bu sorumluluğun bilincinde olmadan meslek seçmiş olanlar veya buna gözü kesmeyenler varsa şimdiden ayrılmalı, kendilerine başka bir meslek seçmelidirler.

İnsanlar hekime güven ve emniyet duygusu içinde gelirler. Bu güven duygusunu sarsmamak için bilgili olmak zorundasınız. Gerekli bilgileri bu sıralarda tek tek öğrenip biriktireceksiniz ve ilerde hastalıkların tanı ve tedavisiyle ilgili bilgilerden oluşan bir hazineniz olacak. Bu hazineyi, zamanı geldiğinde, yetkin bir şekilde kullanmak hem size hemde diğer insanlara mutluluk verecektir.

Tıp öğrencileri için onurlu olmak, dürüst olmak ve diğer etik kurallara uymak esastır. Tıp öğrencisi çağdaş görüşlü, bilgili, saydam ve açık fikirli olmalıdır. Bu özellikler hastalara ve diğer insanlara güven ve itimat telkin etmek için mesleğin her döneminde gereklidir. Bu da ancak sürekli öğrenme kararlılığı ve insani davranışların geliştirilmesiyle olasıdır.

Sevgili arkadaşlarım bu ders kurulundan itibaren, ağırlıklı olarak, başlıca; Anatomi, Histoloji, Embriyoloji, Fizyoloji, Biyokimya, Mikrobiyoloji, Parazitoloji gibi temel tıp dersleri alacaksınız.

Bunlardan herhangi biri diğerine göre az yada çok önemli değildir, hepsi aynı bütünün parçalarıdır. Her birinden öğrendiğiniz bilgileri ilişkilendirerek, sonuçta bir temel tıp bilgisi sentezine ulaşacaksınız.

Bizim dersimizin, Histoloji’nin amacı; tıp öğrenimine başlayan sizlere, insan vücudunu meydana getiren hücre, doku , organ ve sistem’lerin mikroskopik yapısını öğretmektir. Embriyoloji derslerinde ise canlının prenatal dönemdeki gelişim sürecini inceleyeceğiz. Öğreneceğimiz bilgiler sağlıklı ve hastalıklı durumlarda bu yapıların fonksiyonlarının anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Sizlerin kişisel ve grup sorumluluğunuzun bilincinde olarak, eğitim-öğretim kadrosu ve fakülte yönetimiyle uyum içinde çalışacağınıza, kendinize veya grubunuza sorun getirebilecek davranışlardan daima kaçınacağınıza olan inancımız tamdır. Unutmayınız ki; size emek veren ailenize, hocalarınıza ve ulusunuza olan borclarınızı ancak ve ancak çalışarak ödeyebilirsiniz. - Bu duygular içinde sizlere eğitiminiz ve tüm yaşamınız boyunca başarılar diliyorum.

HİSTOLOJİ - Canlı vücudunu meydana getiren hücre, doku ve organların çıplak gözle görülemeyen (mikroskopik) yapılarını inceleyen bir bilim koludur. - Histolojinin sözlük anlamı (histos: doku, logos: bilgi) doku bilimi demektir.

HİSTOLOJİ BİLİMİNDEN ELDE EDİLEN BİLGİLER; - Embriyoloji, Anatomi ve Fizyoloji derslerinde öğrenilen bilgilerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar, - yapı-fonksiyon ilişkisine açıklık getirerek oldukca komplike olan birçok fizyolojik fonksiyonun kolayca anlaşılmasına olanak verir, - ayrıca doku ve organlardaki bozuklukları anlatan Patoloji bilimine de, onların normal yapılarının öğrenilmesini sağlayarak yardımcı olur,

-yine klinik eğitimi sırasında; vaka tartışmalarında, organ ve sistemlerin hastalıklarının teşhis ve tedavilerinin düzenlenmesinde Öğretim Üyesi ve Öğrenci histoloji bilgilerinden yararlanmak zorundadır, hastalıkları teşhis ve tedavi ederken; ne-neden, nasıl-çünkü zincirini oluşturacak bilgi birikiminde Histoloji olmaksızın sonuca varmak zordur.

HISTOLOJI LABORATUVARINA YENI BAŞLAYAN ÖĞRENCILERİN DİKKAT ETMESİ GEREKEN HUSUSLAR 1. - Histoloji'de temel iş doku ve organlardan uygun incelikte küçük preparatlar hazırlayarak bunları mikroskopta incelemektir. Makroskopik olarak izlediğimiz organlar binlerce, hatta milyonlarca küçük fonksiyonel birimlerin birleşmesinden meydana gelmiştir. Bazı büyük organları (örneğin; karaciğer, akciğer, mide gibi) incelemek için bir mikroskop slayt'ı üzerine yerleştirmek mümkün değildir.

Böyle büyük organlardan ancak küçük parçalar alınarak mikroskop slaytları hazırlanır. Büyük organların slaytları değerlendirilirken , incelenen fonksiyonel üniteler ile organın gerçek büyüklüğü arasındaki ilişki zihinde geliştirilmelidir.

2. - Gerçekte üç boyutlu olan oluşumlar mikroskopta iki boyutlu olarak izlenir. Bu görüntü de zihinde geliştirilerek üç boyutlu hale dönüştürülmelidir. 3. - Her hangi bir doku veya organ parçasının görünümü kesit yönüne bağlı olarak farklılıklar gösterir. Böyle durumlarda organın hangi yönde kesildiği ( longitudinal, transversal veya oblik) bilinmelidir.

4. Bazı preparatlarda katlanma, yarıklanma, kıvrılma veya boşluklar gibi kusurlara (artefacts ) raslanabilir. Preparasyon sırasında her türlü özene rağmen bu gibi kusurları tamamen bertaraf etmek güçtür. Onun için , bu gibi durumlar hemen anında öğretim elemanına sorulmalı , yanlış bilgi edinilmemelidir

MİKROSKOP Mikroskop; çıplak gözle izlenemeyen cisimleri tanımak ve değerlendirmek amacıyla ışın ve optik ilkelerine dayanılarak yapılmış bir görme ve büyütme cihazıdır.

İlk, ilkel (prototip) mikroskop 1665 yılında Hollandalı gözlükcü Robert Hook tarafından icat edilmiştir. Mikroskobun morfolojik incelemelerde kullanılmaya başlaması ise 1757 yılında olmuştur. Bu cihazın modern Histoloji alanında kullanılması ise 19. yüzyılın ortalarına raslar. Bu süre içinde çok büyük gelişmeler gösteren mikroskop, aydınlatma kaynağına göre ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu olmak üzere esas itibariyle iki tiptir Işık mikroskobunda aydınlatma kaynağı güneş ışını veya bir lambadır. Elektron mikroskobunda ise cismi aydınlatmak için hızlandırılmış elektron demetleri kullanılır.

- Ölçü birimi olarak ışık mikroskopide mikrometre (10-6 m) kullanılmaktadır. - Elektron mikroskopide ise eskiden Angström (10-10 m) kullanılmaktaydı, son yıllarda nanometre (10-9 m) tercih edilmektedir.

Işık Mikroskopları Ayırım gücü Klasik mikroskop 1- 0.5 mikron   İmmersiyon mikroskobu Faz kontrast mikroskop Ultraviyole mikroskobu 0.5- 0.25 mikron Fleurosans mikroskop Polarizasyon mikroskobu

Elektron mikroskopları Ayırım gücü SEM (Taramalı, scanning elektron mikroskobu) 300 Angstron TEM (İletimli, Transmisyon elektron mikroskobu) 3 Angstron

Bir ışık mikroskobun iki esas kısmı vardır: 1. STATIF, 2. OPTIK SISTEM. 1. STATIF: Optik sistem dışında kalan ve metalden yapılmış olan bütün kısımlar statif (sehpa) diye isimlendirilir. Statifin ; preparat yerleştirilen kısmına tabla, objektifleri taşıyan ve ekseni etrafında hareket ettirebilen kısmına revolver, üzerine okülerin oturtulduğu boru şeklindeki kısmına tüp adı verilir. Tüp kaba ve ince ayarlı kollarla aşağı yukarı indirilip kaldırılabilir.

OPTIK SISTEM: Cisimlerden büyütülmüş görüntü elde etmeye yarayan optik sistem 4 ayrı kısımdan meydana gelir: a. ışık kaynağı, b. kondansör, c. objektifler, d. oküler, a. Işık kaynağı: Doğal ya da yapay ışık kullanılabilir. Işık kaynağı genelde mikroskobun altına monte edilmiştir.

b. Kondansör: Preparat tablasının altında bulunur b. Kondansör: Preparat tablasının altında bulunur. Bir kol aracılığıyla aynı eksen üzerinde aşağı-yukarı hareket ettirilebilir. Birkaç mercekten yapılmıştır. Kaynaktan kendisine gelen ışığı yoğunlaştırarak preparat üzerine yönlendirir. Kondansörün alt yüzünde kondansör diaframı adı verilen bir diafram bulunur. Bunun görevi kullanılan objektifin büyütme gücüyle orantılı olarak ışığı azaltıp çoğaltmaktır. Küçük büyütmeli objektiflerle çalışırken az ışık, büyük büyütmeli objektifle çalışırken fazla ışık gerekir.

c. Objektifler: Objektifler metal bir tüp içine yerleştirilmiş birkaç mercekten oluşur. Bunlar optik sistemde ilk büyütmenin meydana geldiği kısımlardır. Her objektifin üzerinde özelliklerini işaret eden bazı sayılar vardır. Örneğin, objektif üzerinde 40/0.65 - 160/0.17 sayıları varsa, bu sayıların anlamı şudur:

40: objektifin nesneyi kaç kez büyüttüğünü, 0.65: numerik apertür sayısını, 160: objektifin kullanılacağı tüpün uzunluğunu, 0.17: Preparatı kapatmak için kullanılacak lamel kalınlığını (mm) gösterir.

Bazı objektiflerde ( ∞ ) simgesi bulunabilir Bazı objektiflerde ( ∞ ) simgesi bulunabilir. Bu o objektifin her uzunluktaki tüple kullanılabileceğine işaret eder. Yine bazı objektiflerde 0.17 yerine ( 0 ) veya ( - ) işareti bulunabilir. ( 0 ) o objektifin bakteriolojik preparatlarda, ( - ) işareti ise her kalınlıktaki lamelle kullanılabileceğini gösterir.  

Numerik apertür sayısı ne demektir ? Bir mikroskobun ayırım gücü ( resolusyon gücü, çözümleme gücü) numerik apertür sayısı ile ilgilidir. Ayni büyütmeyi sağlayan iki objektiften ; numerik apertür sayısı daha yüksek olanda resolusyon (ayırım) gücü daha fazladır. Ayırım (resolusyon) gücü; birbirine en yakın iki nokta arasındaki mesafeyi gösterir. Not: yukarda verilen ışık ve elektron mikroskoplara ilişkin ayırım güçleri incelendiğinde konu daha iyi anlaşılacaktır. )

Objektifler kendi ekseni etrafında dönebilen bir revolver üzerine yerleştirilmişlerdir. Objektifler kuru sistemli objektifler ve immersiyon objektifleri olmak üzere ikiye ayrılırlar. Kuru sistemli olanlarda obje ile objektif arasında hava bulunur. İmmersiyon objektiflerinde ise daha fazla ışık toplayabilmek için , obje ile objektif arasındaki aralık uygun bir sıvıyla ( su, gliserin, sedir yağı ) doldurulur. En iyi immersiyon sedir yağı ile elde edilir. Çünkü bu yağın ışığı kırma indisi (1.52) obje ve objektifinki ile aynıdır. Havanın ışığı kırma indisi 1.0, suyun 1.33, gliserinin 1.39 dur. Genellikle 40 defaya kadar büyüten objektifler kuru sistemli , 40 dan fazla büyütenler ise immersiyon sistemli olarak yapılırlar.

d. Oküler : Tüpün göze gelen tarafında bulunurlar d. Oküler : Tüpün göze gelen tarafında bulunurlar. Bazı mikroskoplarda bir adet ( monoküler), bazı mikroskoplarda ise iki adet ( binoküler) oküler bulunur. Oküler ; objektifin büyüttüğü görüntüyü tekrar büyüten ve objektifin ışık kusurlarını düzelten birkaç yakınsak mercekten oluşmuş optik kısımdır. Objektiflerde olduğu gibi her okülerin büyütme gücü üzerinde yazılıdır.

Klasik mikroskop Optik kısımlar Statife ait kısımlar tüp oküler revolver statif tabla objektif kondansör ve diafram makro/mikro ayar Işık kaynağı ışık aç/kapa

Son yıllarda, ışık mikroskopların büyütme ve çözümleme yetenekleri ışığa duyarlı video kameralar kullanılarak daha da geliştirilmiştir. Okülerden bakıldığında gözle seçilemeyecek kadar küçük nesneler, kameralar ve görüntü iyileştirici programlar kullanılarak video ekranında izlenebilmektedir. Bu video sistemler canlı hücrelerin uzun süreli izlenmelerine de olanak verir.

MİKROSKOP BAKIMI Mikroskoplar çok pahalı cihazlardır. Bunlardan uzun süreli istifade etmek için bakımlarına dikkat etmek gerekir. Bu amaçla şu hususlara azami dikkatinizi rica ediyoruz: Mikroskopları direkt güneş ışığı, radyatör gibi ortamlardan uzak tutunuz. Mikroskobun diğer bir düşmanıda toz’dur. Bu nedenle mikroskop kullanılmadığı zamanlarda bir örtü ile kapatılmalıdır. Tozlanmış olan kısımlar yumuşak, temiz bir fırçayla temizlenmelidir.

Dış merceklere bulaşmış immersiyon maddeleri önce yumuşak bir bezle alınmalı, sonra 7 kısım eter+3 kısım alkol karışımı ile ıslatılmış yumuşak bir bezle hafifce silinmelidir. Bu amaçla tek başına alkol veya xylol kullanılmamalıdır.

Histoloji Laboratuvarında mikroskop başına geldiğinde yapılacak işlemler: → mikroskobun örtüsünü aç, uygun şekilde katla ve dolabına yerleştir, → mikroskobun kordonunu pirize tak, ışığını aç (açma/kapama anahtarı yanda), → preparat tablasını aşağıya indir, en küçük büyütmeli objektifi devreye sok,

→ incelenecek preparatı yerleştir (mikroskop slaytları mikroskop tablasına yerleştirilirken kesit yapışık olan tarafın üste (objektif'e) dönük olup olmadığı tırnak ucuyla kontrol edilmelidir. Eğer kesit yüzü alta dönük olursa büyük büyütmeli objektifler ile (40,60,100) görüntü elde edemeyiz), → yandan bakarak ve makrovidayı kullanarak objektifi aşağıya indir, tablayı yukarı kaldır,

→ okülerden bakarak , makrovidayı kullanarak görüntüyü netleştir, → küçük objektif ile preparatın her tarafını inceledikten sonra daha büyük büyütmeli objektife geçebilirsiniz, 40X objektif ile inceleme yaparken netlik ayarını mikrovida ile yap ( bu aşamada, netlik ayarı için makrovida kullanırsanız preparata ve merceğe zarar verebilirsiniz!!), → 100X objektif (immersiyon objektifi) ile çalışırken sedir yağı kullanmanız gerektiğini unutmayınız,

→ preparat değiştirdiğiniz zaman tekrar küçük büyütmeli objektifi devreye alarak aynı işlemleri tekrarlayınız, → İncelemeniz bittiğinde; preparatınızı tabladan çıkarın, çıkışta imza karşılığı teslim edilmek üzere güvence altına alın, → küçük büyütmeli objektifi devreye alın, ışık kaynağını kapatıp kordonu prizden çıkartın ve mikroskop üzerine dolayın, mikroskopun örtüsünü her tarafını kapatacak şekilde örtün.

MİKROSKOPİK TEKNİKLER Histoloji gözle görülemeyen yapıları büyütücü araçlar yardımı ile araştıran bilim dalı olduğuna göre bu yapıların büyütücü araçlarla görülebilir duruma getirilmeleri gerekmektedir. İşte organizmadan alınan doku ve organ parçalarının mikroskop altında görülebilir duruma getirilmesi için uygulanan işlemlerin tümü “mikroskopik teknik” veya “mikroteknik” adı altında toplanır.

  Doku ve organları iki şekilde incelemek mümkündür: Canlı (vital) inceleme, 2. Cansız (ölü) inceleme.

CANLI (vital) İNCELEME Genellikle tek hücreli organizmalar canlı incelemeye uygundurlar, - Çok hücreli organizmalarda canlı incelemeler daha çok kan, lenf, sperma, süt, serebrospinal sıvı, synovial sıvı gibi dokulara uygulanır.

Bu sıvılardan herhangi biri temiz bir lam üzerine bir damla damlatılır, üzeri basınç uygulamadan bir lamelle kapatılır ve hemen mikroskop altında incelenir. Serbest hücreler genellikle renksizdirler , içerdikleri yapılar kontrast vermezler. Bu zorluklar bir dereceye kadar faz kontrast mikroskoplarla aşılabilirsede , canlılıklarına zarar vermeden boyanarak incelenmeleri de mümkündür. Bu amaçla vital boyalar kullanılır. Vital boyalar az toksiktirler, hücreyi öldürmezler, özellikle ilgi duydukları hücre yapıları üzerine oturarak onları seçilebilir hale getirirler.

- Canlı inceleme derialtı bağ dokusu, kas telleri, sinir telleri, mezenteryum, omentum ve epitel kazıntıları gibi yumuşak yapılara da uygulanabilir. Bu amaçla anılan dokulardan alınan biopsi örnekleri bir lam üzerine konur, ucu ince olan özel iğnelerle tiftiklendikten sonra üzeri hemen lamelle kapatılıp mikroskopta incelenir.

2. CANSIZ (ölü) İNCELEME Bu tür incelemede doku ve organlardan alınan örnekler çeşitli mekanik ve kimyasal işlemlerden geçirilerek daimi preparatlar haline dönüştürülür ve mikroskop altında incelenir. Doku ve organlardan daimi preparatlar hazırlamak için sırasıyla şu işlemler yapılır:

a. Dokunun alınması b.Tespit (fixation) c. Yıkama (tespit maddesinin uzaklaştırılması) d. Dehidrasyon ( suyunu giderme) e. Parlatma (clearing, şeffaflandırma) f. Emdirme ( embedding) ve bloklama g. Kesme h. Kesitleri lam üzerine alma ı. Kesitleri boyama. j. Kapatma.

Dokunun alınması: - Histolojik amaçlarla insanlardan materyal alınması her zaman mümkün değildir. - Genellikle ameliyatlarla dışarı alınan bazı patolojik doku ve organların etrafında bulunan sağlıklı doku kısımları histolojik incelemeler için değerlendirilir. - Bu amaç için en iyi kaynak deney hayvanlarıdır.

- Deney hayvanlarından doku ve organ parçalarının anestezi altında alınması en uygun yoldur. - Organizma henüz canlı iken incelenecek parçanın alınması işlemine biopsi adı verilir. - Organizma öldükten sonra İncelenecek parçanın alınması işlemine autopsi adı verilir.

-İncelenecek doku örneklerinin ölümden mümkün olduğu kadar kısa bir süre içinde alınıp tesbit edilmesi gerekmektedir. - Çünkü hücre öldükten sonra bir seri kimyasal değişimlere uğrar ve görünümü değişir, bu da doku incelenirken yanlış yorumlara neden olur. Hücre öldükten sonra meydana gelen bu değişimler postmortem degeneration’lar adını alır.

Özetle dokuların alınmasında şu hususlara önemle uyulmalıdır: 1. Doku parçası anestezi altında alınmalıdır, 2. Keskin bir bıçak kullanılmalıdır. 3. Doku alımında kör bıçak veya makas kesinlikle kullanılmamalıdır. 4. Doku veya organ parçasının büyüklüğü 3-4 mm’yi geçmemelidir. Bir organdan genişce bir parça almak zorunluluğunda isek hiç olmazsa bu parçanın kalınlığının 3-4 mm’yi geçmemesine dikkat etmeliyiz.

b. Tespit (fixation ): - Vucuttan alınan dokular mümkün olan en kısa sürede uygun bir kimyasal işleme tabi tutulurlar. - Burada amaç dokuların enzimlerce veya bakteriler tarafından yenmesini önlemek ve histofizyolojik yapısını normaldekine yakın bir durumda muhafaza etmektir, başka bir deyişle postmortem degenerasyonları önlemektir. Bu işleme tespit (fixation) denir.

İyi bir tesbit maddesi en az şu üç özelliği taşımalıdır: 1. Doku unsurlarını tespit etmeli, postmortem değişimleri önlemelidir. 2. Dokuyu sertleştirerek ince slaytlar halinde kesilmesini kolaylaştırmalıdır. 3. Eğer alınan doku parçası içinde herhangi bir hastalık etkeni varsa onu öldürerek araştırmacı için zararsız kılmalıdır.

- Tespit için kullanılan kimyasal maddelerin en önemlileri formalin, potassium bichromate, mercuric bichloride, picric acid, osmic acid, acetic acid, alkol, kloroform, aseton gibi maddelerdir. - Bu maddelerden hiçbirisi hücreyi bütünüyle mükemmel bir şekilde tespit etmez. Herbirinin özel üstünlükleri yanında yine kendilerine özgü dezavantajları da vardır. Bir kısmı çekirdek üzerine iyi tesir ederken bazıları da sitoplazma kısımlarını iyi tespit eder.

c. Yıkama : - Yeteri kadar tespit edilmiş olan doku ve organ parçaları fazla tespit maddesinin giderilmesi için yıkama işlemine tabi tutulur. - Genellikle bu işlem akar su altında (çeşme suyu) yapılır. Ancak pikrik asit, triklor asetik asit gibi maddeler içeren tespitler (Bouen, Carnoy, Susa gibi) ve alkol gibi tespitlerden sonra suda yıkama yapılmaz , bu gibi tespit maddelerinin dokudan uzaklaştırma işlemi alkoller içerisinde yapılır.

Yıkama işlemi tamamlanmış olan doku parçası için müstakbel olaylar şöyle gelişebilir: 1) Doku parçası başka bir işleme gerek kalmadan doğrudan doğruya dondurma mikrotomunda dondurularak kesilir. Bu yöntemle ince kesitler almak zordur. Bu nedenle sadece zorunlu durumlarda başvurulur. Örneğin; kemik doku kesitlerinde, adipöz dokuların demonstrasyonunda, bazı özel çalışmalarda ve çok acil olan durumlarda ( ameliyatlar anında) bu yönteme başvurulur.

2) Doku parçası parafin, paraplast, celloidin, jelatin gibi sertleştirici bir madde içine gömülerek kesilebilir. Bunlardan en genel ve kullanışlı olanı parafine yatırarak kesmektir. Dokulardan parafin blokları hazırlanacaksa aşağıdaki işlemler yapılır :

d. Dehidrasyon ( suyu giderme ) : - Dokular büyük oranlarda su içerirler. Hele suda yıkama işleminden sonra su miktarı iyice artmıştır. Doku parçası parafin, celleodin ve plastik maddelere gömülecekse suyunun tamamen giderilmesi gerekir. Çünkü bu maddeler suda erimez, yöntemin özü ise dokunun en ince gözeneklerine kadar sertleştirici maddeyi nüfuz ettirmektir. Bu küçük gözeneklerde su kalırsa maddeler oralara giremez ve iyi kesitler alamayız. Bu step sonunda dokularda hiç su kalmamalıdır.

Bu amaçla en yaygın olarak etilalkol’den yararlanılır Bu amaçla en yaygın olarak etilalkol’den yararlanılır. Dehidrasyona genellikle %70 alkolden başlanır ve sırasıyla %80, %90, %96 , %100 alkollerden geçirilir. Dehidrasyonun süresi doku parçasının büyüklüğüne, cinsine, kalınlığına ve tespit maddesine bağlı olarak 1-2 saat ile 24 saat arasında değişebilir. Yıkama işlemi alkol ile yapılmış ise doku parçasının suyunu giderme işlemine yıkamadaki alkol derecesinden itibaren başlanır.

e. Parlatma (saydamlaştırma): - Bundan önceki steptde dokudaki suyun yerini alkol almıştı. Ancak parafin alkolde de erimez. Bazı maddeler vardır ki hem alkolü hem de parafini eritebilir. Xylol (xylene), toluol, chloroform, sedir yağı, eter, metilbenzoat bu maddelerdendir. Bunlar parlatma maddeleri ( clearing agents) olarak bilinirler. Doku parçaları bu maddelerden biri içine alınırlar. Daha önce suyun yerini alkol aldığı gibi bu kez de alkolün yerini parlatıcı madde alır. Bu maddeler aynı zamanda dokuyu saydamlaştırır.

f. Emdirme (embeding) ve bloklama: Tespit, yıkama, dehidrasyon ve parlatma işlemlerinden sonra sıra doku parçalarına parafin, celloidin, plastik madde, jelatin gibi sertleştirici maddelerden birini emdirme işlemine gelmiştir. Bunlardan en çok kullanılan parafindir. Dokular erimiş parafin içerisine yerleştirilir ve daha sonra donmaya terkedilir.

g. Kesme: Şimdiye kadar yapılan işlemler sonucu, doku parçalarının sertleştirici maddeler içine yatırılmasının gayesi onu ince şekilde kesmektir. İşte incelenecek doku parçalarından elde edilen bu ince dilimlere kesit (coupe) adı verilir. Bu kadar ince kesitler ancak mikrotom adı verilen aletler yardımıyla gerçekleştirilir. Mikrotomlar oldukca karışık yapılı ancak kullanılmaları çok kolay olan aygıtlardır. Dondurma, kızaklı ve rotatif mikrotom tipleri oldukca yaygındır.

h. Kesitleri lam üzerine alma: - Mikrotomda elde edilen İnce kesitler bir fırça yardımıyla önce oda sıcaklığındaki suya alınır, varsa katlantıları düzeltilir , sonra temiz bir lam üzerine alınır ve tozsuz ortamda kurutulur.

ı. Kesitleri boyama: Yukarda anlattığımız steplere uygun şekilde hazırladığımız bir kesit henüz daha mikroskopta incelenecek duruma gelmemiştir. Bunu bir fotoğrafın negatifine benzetebiliriz. Fotoğrafta ne olduğunu tam olarak anlamak için onu boyayarak renklendirmek gerekir.

I. Kapatma : - Boyanmış preparatın uzun süre saklanabilmesi , rengini koruyabilmesi için kapatılması gerekir. - Kapatıcı maddeler ( kanada balzamı, entellan vs) suyla bağdaşmaz. - Preparatın suyunu gidermek amacıyla yüksek dereceli alkollerden ( 96 alkol , 96 alkol, 100 alkol, 100 alkol, 100 alkol , herbirinde 2-3 ‘er dak.) geçirilirler.

- Daha sonra iki veya üç kez ksilol dan (herbirinde 5’er dak - Daha sonra iki veya üç kez ksilol dan (herbirinde 5’er dak.) geçirilirler. - Ksiloldan çıkarılan kesitlerin üzerine bir damla kapatıcı madde damlatılır ve üzeri uygun bir şekilde, lamel ile kapatılır.

Bu işlemlerden sonra artık preparatımız mikroskopta incelenmeye hazır hale gelmiştir ve uzun yıllar kullanılabilir.