Araş.Gör.Dr.Fatma Esenkaya Taşbent Danışman: Yrd.Doç.Dr.Mehmet Özdemir İTALYA’ DA FLOROKİNOLONLARA DİRENÇLİ CLOSTRIDIUM DIFFICILE İZOLATLARI: PCR RİBOTYPE 018’ İN ORTAYA ÇIKIŞI Araş.Gör.Dr.Fatma Esenkaya Taşbent Danışman: Yrd.Doç.Dr.Mehmet Özdemir

Journal of Clinical Microbiology, Aug. 2010, p. 2892-2896

GİRİŞ: Clostridium difficile basit diareden pseudomembranöz kolite kadar değişebilen hastalıklara sebep olan, anaerobik, gram (+), sporlu basildir. Clostridium difficile infeksiyonlarının görülme riski, belirli antimikrobiklerle birlikte daha yüksektir ve suşlar antimikrobiklere dirençli ise bu risk artmaktadır.

GİRİŞ: Son zamanlarda, virulansı yüksek, pulsed-field gel elektroforezde NAP1 patterni gösteren, PCR Ribotype ile 027 ve toxin tip III olarak tiplendirilen yeni C.difficile suşları ABD’de , Kanada’da, Japonya’ da ve Avrupa’ da daha ciddi ve fatal vakalarla ilişkilidir. 027 izolatlarının suşu, toxin A ve B’ nin fazla üretimiyle, binary toxin üretimiyle ve eritromisin ve kinolanlara dirençli olmasıyla karakterizedir.

GİRİŞ: Bu antibiyotiklere dirençli karakterler sadece 027 suşu değildir fakat hastalıktan sorumlu olan ve hastane çevresinde yayılan C. difficile suşlarının çoğunluğudur. Makrolid-Linkozamid- Streptogramin B (MLSB) antibiyotiklerinin kullanımının C. difficile infeksiyonları için major risklerden biri olduğu uzun zamandır biliniyor Özellikle eritromisin ve klindamisin olmak üzere bu antibiyotiklere direnç , heterojen genetik organizasyon gösteren mobil bir element olanTn 5398 tarafından taşınan erm (eritromisin ribozomal metilaz) geninden kaynaklanır.

GİRİŞ: Bununla birlikte, MLSB’ ye dirençli PCR ribotype 027 olarak karakterize suşlar içeren erm (-) C. difficile izolatlarının sayısında bir artış bildirildi Tarihsel olarak, Florokinolonlar C. difficile infeksiyonları ( CDİ) için düşük riskli kabul edildi. Fakat son zamanlardaki veriler güçlü bir şekilde CDİ ile florokinolonların kullanımı arasındaki ilişkiyi göstermektedir.

GİRİŞ: Florokinolonlara direnç sadece epidemik 027 suşlarında tarif edilmemiş ayrıca diğer önemli PCR ribotiplerinde de tarif edilmiştir ve bu direnç artmaktadır. Son veriler Avrupa’ daki C. difficile klinik izolatlarının % 37.5 ‘nun dirençli suşlar olduğunu göstermektedir. Florokinolonlara dirençte iki ana mekanizma tespit edildi: DNA giraz ve topoizomeraz 4 gibi antibiyotiklerin hedeflerinde değişim ve bakteri içinde ilaç toplanmasının azalması.

GİRİŞ: Diğer birçok bakteriyel türlerde olduğu gibi C. difficilede direnç, hedef enzimlerin kinolon direncini tanımlayan bölgelerindeki(quinolone resistance-determining region:QRDR) amino asit yer değişimleriyle tesbit edilmiştir Bu bakterinin topoizomeraz 4 için genlere sahip olmamasından bu yana, bu değişiklikler DNA giraz subünitleri olan Gyr A yada Gyr B’ nin kinolon direncini tanımlayan bölgelerine yerleştirilmiştir

GİRİŞ: Son çalışmalar göstermiştir ki, virulansı yüksek epidemik 027/NAP1/III klonlarını içeren, Florokinolonlara dirençli Avrupadaki toksijenik C.difficile izolatlarının % 93’ ü, Gyr A’ daki Thr 82 nin Ile ile yer değiştirmesiyle karakterizedir. Kalan % 7 Gyr B’ nin 426. pozisyonunda baz yer değişimi göstermektedir

GİRİŞ: İtalyada klinik C.difficile izolatlarının Florokinolon direnciyle ilgili birkaç veri mevcuttu ve bu çalışma için, 1985’ ten 2008’ e kadar İstituta Superiora di Sanitada toplanan uygun toksijenik izolatlarda, moksifloksasin için MİK değerleri ve Gyr A ve Gyr B deki baz değişiklikleri analiz edildi.

GİRİŞ: Ayrıca tüm dirençli C.difficile suşlarının siprofloksasin, gatifloksasin, levofloksasine dirençleri ve MLSB direnci ile florokinolon direnci arasında bir ilişki olup olmadığı araştırıldı. Dirençli izolatların tiplendirilmesinde PCR ribotyping metodu kullanıldı.

Materyal ve metod: Toplam 147 toksijenik C.difficile izolatı seçildi ve analiz edildi. Bu suşlar, 1985-2008 yılları arasındaki beş farklı salgından ve sporadik vakalardan izole edildi. Örnekler İtalyanın kuzeyi ve merkezinde yer alan dokuz farklı hastaneden toksijenik ve moleküler analiz için İstituta Superiora di Sanitaya( ISS ) gönderilmişti.

Materyal ve metod: Dışkı kültürü C.difficile için pozitif ve/ veya fekal sitotoksin B si olan bir hastada bir sporadik vaka diare olarak tanımlanırken, bölgesel olarak belli bir süreçteki iki veya daha fazla sayıdaki ilişkili vakalar bir salgın olarak tanımlandı. C.difficile suşları gönüllü olarak ISS’ ye gönderildi.Dolayısıyla farklı hastanelerden her bir yıl için alınan suşların sayıları değişkendi.

Materyal ve metod: Her yıl için alınan suşların en azından % 50 si seçildi ve çalışmaya dahil edildi. Sporadik vakalardaki suşlar rastgele seçilirken, salgın başına yalnızca iki C.difficile suşu ve tek hasta için yalnızca bir suş analize dahil edildi.

Materyal ve metod: Ülkedeki geçen yıllardaki C.difficile infeksiyonlarına ilgi arttığından beri, enstitüye kabul edilen C.difficile suşlarının sayısında bir artış vardır. 1985’ ten 1989’ a yalnızca salgınlardan izole edilen C.difficile suşları kabul edildi ve bu çalışma için üç farklı hastanede ortaya çıkan üç farklı epidemiden 6 suş çalışmaya alındı( A,B,C).

Materyal ve metod: 1990’ların başlangıcından itibaren, sporadik vakalardan ve her iki salgından da izole edilen daha yüksek sayıdaki suşlar , birkaç hastane tarafından ISS’ ye gönderildi 2002’ den 2008’ e dört farklı hastaneden izole edilen 77 suş ( E,F,G,I) seçilirken, 1991’ den 2001’ e beş farklı hastaneden izole edilen 64 suş (D, E, F, G, H) seçildi. 2002 ve 2007 ‘de H ve G hastanelerinde iki farklı salgın görüldü.

Materyal ve metod: Sonuçların analizi için, suşlar iki gruba ayrıldı. Birinci gruba 1985’ ten 2001’ e 70 izolat dahil edildi.İkinci gruba 2002’ den 2008’e 77 izolat dahil edildi. 1987’ den 2001’ e kadar olan süreçte İtalyada yayılan baskın tiplerden iki C.difficile suşu ( A ve R olarak isimlendirilen ) ve PCR ribotype ile 027 veya 017 olarak tiplendirilen iki uluslararası referans suşu, PCR ribotyping için kontrol suşu olarak kullanıldı.

Materyal ve metod: Hafif zincir giraz mutasyon analizi: Giraz mutasyon çalışmasında giraz A’ nın 82. kodonundaki ve giraz B’ nin 426. kodonundaki direnç mutasyonlarının varlığı hafif zincir analizi kullanılarak belirlendi.Veriler yavaş zincir software 5.3.2 versiyonu ile analiz edildi. Florokinolonlara duyarlı uluslararası referans suşu, C. difficille 630 wild type sekans ile giraz genleri bulunan izolatların temsilcisi olarak kullanıldı.

Materyal ve metod: Antibiyotik duyarlılıkları: Moksiflaksasin, levoflaksasin, gatiflaksasin, siproflaksasin, eritromisin, klindamisin MIC değerleri %5 defibrine koyun kanlı agarda ve Vit K1 eklenmiş Brucella agar plaklarında E test kullanılarak belirlendi. Bu çalışmada kullanılan tüm test edilen antibiyotikler için CLSI ya göre sınır noktası 8 µg/ ml idi. Bacteroides thetoioteomicron ATCC 29741 kontrol suşu olarak kullanıldı.

Materyal ve metod: Erm(B) Genlerinin Bulunması: Erm(B) ‘nin MLSB dirençli C.difficillede baskın olduğu bilindiğinden beri, bu sınıfa ait genlerin varlığı, E5 ve E6 primerleri kullanılarak PCR ile araştırıldı ve tanımlandı.

Materyal ve metod: PCR ribotyping ve filogenetik analiz: PCR ribotyping analizleri Bidet ve arkadaşlarının metodları kullanılarak yapıldı. İlk izolat Birleşmiş Krallığın Wales Üniversite hastanesinin anaerob referans laboratuvarının önerdiği şekilde her bir PCR ribotype ile identifiye edildi.

Gyr genlerindeki mutasyonların bulunuşu ve florokinolonlara direnç: Sonuçlar: Gyr genlerindeki mutasyonların bulunuşu ve florokinolonlara direnç: Toplamda 147 izolatın 50 si (% 34) giraz genlerinde mutasyonlar gösterdi. Erime noktası yaklaşık 52,2 ˚C olan 48 suş identifiye edildi. Yaklaşık 59,3 ˚C deki erime noktası Gyr A sekansı ile karekterize iken, 52,2 ˚C olan bu erime noktası Gyr A nın 82. kodonunda ACT (Thr) nin ATT (Ile) ye transisyonu ile karekterizedir.

Sonuçlar: Gyr B analizleri gösterdi ki 2 suş, 52,8 ˚C de genin 426. pozisyonunda GAT (Asp) nin AAT (Asn) ye transizyonunu gösteren bir erime noktasına sahiptir. Diğer bütün suşlar, yaklaşık 58.3 °C de 426. pozisyonunda mutasyon olmaksızın Gyr B genleri ile karakterize olan bir erime noktasına sahiptir İdentifiye edilen baz yer değiştirmeleri bu çalışmada önceden C.difficile izolatlarını tanımladı.

Sonuçlar: Genel olarak Moksifloksasin için MİC değerleri 0.5- 32 µg/ ml aralığında değişmektedir. Moksifloksasin için elde edilen E test değerleri Real Time PCR ile doğrulandı Aslında MİK’leri 8-32 µg/ ml arasında olan ve baz yer değişimi gösteren 50 izolat moksifloksasine dirençli iken, giraz geninde baz yer değişimi yapmayan bütün suşlar duyarlıydı.

Sonuçlar: Diğer florokinolonlar için bu suşların MİK aralıkları aşağıda görüldüğü gibi test edildi: Gatifloksasin için 8-32 µg/ ml , siprofloksasin için 24-32 µg/ ml , levofloksasin için >32 µg/ ml

Sonuçlar: Bu çalışmada farklı mutasyonlar gösteren dirençli suşların MİK değerlerinde anlamlı farklılıklar gösterilmedi 2002’ den 2008’ e kadar olan ikinci grupta florokinolonlara dirençli C.difficile izolatlarının oranı % 56 (43/77) iken, 1985’ten 2001’ e kadar izole edilen suşlarda yüzde oranları % 10 (7/70) bulundu

Sonuçlar: Erm (B) geninin bulunuşu ve MLSB direnciyle ilişkisi: Florokinolonlara dirençli C.difficile izolatlarının % 98 ‘i aynı zamanda eritromisin ve klindamisine de dirençliydi MİK değer aralıkları eritromisin için 1-256 µg/ ml arasında, klindamisin için 0.5-256 µg/ ml arasındadır Toplamda sadece sekiz tane MLSB dirençli (% 16) C.difficile izolatında erm (B) geni vardır

Sonuçlar: 2002’ den 2008’ e kadar izole edilenler arasında erm (B) pozitif izolatların oranı % 9 iken, 1985’ ten 2001’ e kadar izole edilen dirençli suşlar arasında erm (B) içerenlerin oranı % 57 olarak bulundu. Erm (B) geni içeren izolatların hepsi hem eritromisin hem de klindamisine dirençli bulundu. Erm (B) negatif olan C.difficile izolatları eritromisine dirençli ve klindamisine dirençli yada duyarlıydı. Yalnızca bir izolat eritromisine duyarlı ve klindamisine dirençliydi.

Sonuçlar: PCR ribotyping ve filogenetik analiz: Toplamda altı farklı PCR ribotip (001, 020, 012, 018, 078, 126 ), florokinolonlara dirençli C.difficile suşu olarak identifiye edildi. 1985’ ten 2001’ e kadar olan C.difficile izolatlarının hiçbiri 027 ve 017 ribotip olarak tiplendirilmedi. İki suş 001 tip, iki suş 126 tip ve her biri için birer tane olmak üzere 012, 020, 078 tip olarak bulundu.

Sonuçlar: 2002- 2008 arasında toplanan suşlardan % 56’ sı tip 126, % 40’ ı tip 018 ve % 2’ si 020 ve 001 olarak tiplendirildi İlginç olarak 2007-2008 arasında PCR ribotip 018 suşu baskın iken, 2002 ve 2005 arasında PCR ribotip 126 suşu baskındı. C.difficile suşları 2002 ve 2007 de meydana gelen iki farklı salgından izole edildi ve sırasıyla PCR ribotip 126 ve 018 olarak tiplendirildi

Sonuçlar: 1987 den 2001 e kadar olan süreçte İtalya’ da baskın olan ve A ve R olarak isimlendirilen suşlar bu çalışmada PCR ribotiplendirme ile sırasıyla 012 ve 078 olarak isimlendirildi 2002 ile 2008 arasındaki erm (B) pozitif izolatlardan ikisi PCR ribotip 126, bir tanesi PCR ribotip 001 ve bir tanesi PCR ribotip 020 iken, 1985 ile 2001 arasındaki erm (B) pozitif dört C.difficile suşundan ikisi PCR ribotip 001, biri 012, diğeri 078 olarak tiplendirildi.

Sonuçlar: 97 duyarlı C.difficile suşunun bu çalışmadaki analizinde %26.5’ i ribotip 078, %27.6’ sı ribotip 012, % 16.2’ si 020, % 8.8’ i 002, %4.4 ‘ ü 045 ve %26.6’ sı diğer ribotiplerdi Filogenetik analiz iki farklı gruba ait florokinolonlara dirençli C.difficile suşlarını gösterdi. İlki PCR ribotip 001, 020 ve iki kontrol suşu 027-017 olarak tiplendirilerek gruplandı İkinci grup PCR ribotip 012, 018, 078 ve126 tiplerini içeriyordu.

Sonuçlar: İlginç olarak aynı gruptaki diğer tiplerle karşılaştırıldığında 018 tipi % 57.9 benzerlikle daha uzak bir ilişki gösterirken, 078 ve 126 tipleri % 91.3 benzerlikle genetik olarak yakından ilişkiliydi.

Tartışma: Florokinolonlar, özellikle de geniş spektrumlu C-8- methoxyflorokinolonlar 1990’dan beri enfeksiyonların çok çeşitli tedavilerinde yaygın olarak olarak kullanılan geniş spektrumlu antibiyotiklerdir. Florokinolon direnci C. difficilenin son klinik izolatlarında artmıştır ve bu yüzden florokinolon kullanımı CDI için önemli bir risk faktörü haline gelmiştir.

Tartışma: İtalya’da antibiyotikler için ulusal harcamaları etkileyen en fazla ilaç grubları Makrolidler (%23) ve kinolon/ florokinolon grubu (%21)’dur.

Tartışma: 2000 ve 2008 yılları arasında kinolon/florokinolonların ortalama tüketiminde 4 milyon doz gibi önemli bir artış görülmekle birlikte son yıllarda makrolidlerin ortalama tüketimi sabit kalmıştır. İtalyan hastanelerde antibiyotik kullanımı ile ilgili uluslararası literatur çalışması az olsa bile İtalyanın kuzeyinde bulunan beş hastanede 2002 ve 2004 yılları arasında yapılan bir çalışmada florokinolanların toplam tüketiminde % 29’luk bir artış olduğu izlenmiştir.

Tartışma: 2002’de 100 yatak başına düşen tanımlanmış doz %11,3 iken, 2004 de bu oran 14,57 olarak gözlenmiştir. Özellikle 2004 yılında kullanılan florokinolonların yaklaşık % 95’ini levofloksasin ve siprofloksasin birlikte oluşturmuştur. Yeni çalışma, 1985 den 2008’e kadar farklı İtalyan hastanelerini dolaşan florokinolon dirençli C. difficile izolatların klinik olarak ilk karakterizasyonudur.

Tartışma: Toplamda 147 analiz edilen suş arasında 50 tane dirençli izolat bulundu 1985-2001 (%10 resistans) ile 2002-2008 (% 56 resistans) yılları arası karşılaştırıldığında dirençte önemli bir artış izlendi (p<0,001). Avrupa ortalamasından (% 37,5) daha yüksek direnç oranı, son yıllarda gözlenen ve florokinolonların artan kullanımı ile örtüşen, hastane ortamlarında florokinolon dirençli C. difficile suşlarında büyük bir yayılma olduğunu gösterir.

Tartışma: Dünya çapındaki dirençli C. difficile suşlarının büyük çoğunluğunun olduğu gibi, C. difficile dirençli izolatların %96’sı, Gyr A’ da Thr82 ile Ile arasında yer değiştirme göstermiştir. Daha önce tanımlanan bazı C. difficile suşlarından sadece 2 tanesinde GyrB de Asp426 nın Asn ile baz yer değişimi vardı.

Tartışma: Sonuçlar hafif zincir testinin etkinliğini doğrulayarak sırasıyla Gyr A ve gyr B nin 82 ve 426. kodonundaki mutasyonu tespit etti. Aslında tüm suşlar baz yer değiştirmeleri sonucu florokinolona direnç gösteriyordu ve bunlar arasında uyumsuzluk tespit edilmedi.

Tartışma: Bu nedenle, hafif zincir yöntemi bazı florokinolon dirençli C. difficile suşlarını tesbit etmede, daha zaman alıcı olan DNA ve duyarlılık testi ile karşılaştırıldığında, maliyet etkinliği daha iyi, hızlı ve tekrarlanabilir bir alternatif olarak kabul edilebilir. Bu metodun kısıtlılığı, Efflux mekanizması gibi C. difficile de olmadığı düşünülen mekanizmaların neden olduğu değişik kodonlarda mutasyonlar sonucu görülen dirençtir

Tartışma: Eritromisin ve klindamisin direncine gelince, suşların %58 i sadece eritromisine (29/50), % 38 i (19/50) hem eritromisin hem klindamisine, % 2 si (1/50) ise sadece klindamisine dirençli olarak tesbit edildi. İlginç olarak erm(B) negatif olan C. difficile izolatlarından % 84 u eritromisin ve/veya klindamsine dirençli idi. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar bu eğilimi doğrular niteliktedir.

Tartışma: Erm(B)-negatif C. difficile suşlarının aynı zamanda diğer önemli erm sınıfları ve efflux pompalar icinde negatif olmasından dolayı , bu suşların kökenlerindeki direnç mekanizmasını tanımlamak için ilerde yapılacak çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. MLSB antibiyotik ve florokinolon kullanımının CDI için önemli risk faktörlerinden biri olduğu bilinmektedir.

Tartışma: Genel olarak, bu çalışmada analiz edilen C. difficile izolatlarında moksifloksasin ve eritromisine birlikte direnç % 96 bulundu ve bu yüksek oran diğer ülkeler incelendiğinde onlarda da görüldü. Aktarılabilen genetik elemanlar ve nükleotid mutasyonu gibi değişik direnç mekanizmalarının birikmesi ve muhafaza edilmesi, artan sayıda antibiyotiklere direnç gelişmesiyle ve şiddetli enfeksiyonların kontrolünün sınırlanmasıyla sonuçlanmıştır.

Tartışma: Bu çalışmada analiz edilen florokinolon dirençli suşların çoğunluğu PCR ribotip 126 veya 018’ e ait idi. Her iki PCR ribotipleri de sporadik vakalar veya salgınlar için sorumlu olarak bulunmuştur 2007 ve 2008 yıllarında baskın olan PCR ribotip 018 iken, PCR ribotip 126, 2002-2005 yılları arasında en sık görülendi. Her iki PCR ribotipleri insan izolatlarından(2, 9, 23, 28) tespit edilmiştir, ayrıca bu PCR ribotipleri hayvanlardan da izole edilmiştir.

Tartışma: İki baskın tür olan A ve R, 1990 ve 2001 yılları arasında ülkede yapılan çalışmada, sırasıyla 012 ve 078 PCR ribotipleri olarak bulundu. Filogenetik analizler, 126 ve 078 PCR izolatlarının benzerlik oranının yüksek olduğunu gösterdi. Bu çalışmada ribotip 078 olan eski İtalyan suşlarınin %62 sinin eritromisine dirençli , erm (B) negatif , florokinolonlara ise duyarlı olduğu bulundu.

Tartışma: 078 ve 126 PCR ribotip izolatları genetik olarak yakından ilişkilidir ve bunlar dirençli suşların ataları olabilir. 126 PCR ribotiplerinin, bir erm (B) negatif C. difficile PCR 078 izolatı tarafından türemiş olması mümkündür. Göründüğü kadarıyla PCR 018 ribotiple ilgili olarak, filogenetik analizler bu tipin daha önce ülkede bulunmadığını gösterir ve bu yüzden İtalya için "yeni" bir PCR ribotipi gibi görünmektedir.

Tartışma: İlginç olarak 2006 yılından itibaren bu PCR ribotip suşlarının toplam sayısının % 51'i bu enstitütü tarafından analiz edilmiştir. Tüm bu İtalyan PCR ribotip izolatları florokinolona dirençli bulunmuş. Antibiyotik kullanımının artmasının bu suşların yayılmasında belirleyici bir rol oynadığını düşündürmektedir

Tartışma: PCR ribotip 018 diğer ülkelerde nadiren tespit edilmiştir ve ne yazık ki, hiçbir veride florokinolon duyarlılığı izlenmemiştir. PCR ribotip 018 C. difficile suşları, hipervirulan suşların tipik karakterini göstermemektedir. Toxin içeren tip olarak yazılmasına rağmen binary toksin negatif olarak izlenir ve patolojik bölgelerdeki analiz ile gösterilen tcdD ve tcdC düzenleyici genlerinde anlamlı farklılık bulunmamaktadır.

Tartışma: Florokinolon direnci yanı sıra, bu suşların yayılma ve hastalık yapma yeteneği diğer virulans faktörlerine bağlı olabilir, PCR ribotype 018 izolatlarının karakterizasyonu devam etmektedir.

Tartışma: Genel olarak, bu çalışmada elde edilen sonuçlar florokinolona dirençli C. difficile suşlarının sayısında bir artış olduğunu göstermektedir ve zaman içinde C. difficile izolatlarının tipi ve prevelansı değişmektedir. Sonuçlar C. difficile populasyonundaki değişikliklerin hızlı taranması için antimikrobiyal duyarlılıkların görüntülenmesi, izolatların tiplendirilmesi ve epidemik klonların ortaya çıkmasında hızlı müdahalenin önemini vurgulamaktadır.

TEŞEKKÜRLER