HEMOSTAZ LABORATUVARINDA PREANALİTİK EVRE Dr Adnan HAŞİMİ Tıbbi Biyokimya Uzmanı

GİRİŞ Kaliteli laboratuvar sonuçları uygun örnek analizi ve raporlamanın yanı sıra, analiz öncesi kullanılacak numunenin uygunluğuna bağımlıdır. Analitik sistemler ve bilişimdeki son yıllardaki gelişmeler nedeniyle hemostaz testlerinde laboratuvar sonuçlarındaki tutarsızlıkların en önemli sebebinin preanalitik evrede olduğu kabul edilir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Preanalitik hatalar Hasta-örnek uygunsuzluğu/karıştırılması, Örnek alımı veya ön işlemi sırasındaki hatalar Örnek transportu veya saklanması sırasındaki uygunsuz koşullar. Ayrıca invivo hemoliz, lipemi, ikter ve bazı ilaçları kullanımı gibi hastaya bağımlı faktörler de tutarsız sonuç raporlanmasına yol açabilir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Preanalitik hatalar Pre-analitik evredeki uygun olmayan işlemler bazı trombosit ilişkili ve plazma faktörleri aktivitelerinin azalmasına neden olurken diğerlerinin artışına yol açabilir. Örneğin, numunenin soğukta kalması F VII aktivitesinde artışa yol açarken faktör VIII aktivitesinin azalmasına neden olur. Analizlere yansıması bu değişiklikler doğrultusunda meydana gelir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Preanalitik hatalar Hemostaz laboratuvarına gönderilen örnekler preanalitik evre hatalarına daha fazla açıktır. Hemostatik sistemin trombositleri, pıhtılaşma faktörleri ve fibrinolitik faktörler gibi yapı taşlarının invitro labillitesi oldukça fazladır. Koagulasyon test verilerinin güvenirliği ve kalitesinin iyileştirilmesi için hemostaz testlerinde preanalitik evrenin standart olması şarttır. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK (KAN) ALMAK Hasta ve Örneğin Doğru Tanımlanması Doğru tanımlama veya etiketleme hayati önem taşır. Bu amaçla hasta ve örnek tanımlama ve etiketleme önlemleri alınır. Örnek tüplerinin etiketleri kan alınmadan önce tüplerin üzerine kesinlikle yapıştırılmaz; tüplerin etiketi kan örneği alındıktan sonra hastanın yanında ve kan alım yerinde yapıştırılmalı. Kan örneği alım gün ve saatiyle de flebotomistin kimliği kaydedilmeli. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK (KAN) ALMAK Kan alımından önce vericinin aşırı yorgunluğu, aşırı üzgün olması hatta verici çocuk ise ağlaması vWf, F-VIII ve fibrinojen gibi akut faz reaktanı olan hemostaz proteinlerinin artmasına neden olabilir. Sonucunda F-VIII ve fibrinojenin hatalı olarak yüksek, aPTT’nin hatalı kısa bulunabilir; veya gerçekte düşük olan değerler normale gelerek hemofili veya vW hastalığı tanısı engellenebilir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK (KAN) ALMAK İnvitro pıhtı sonucunda fibrinojen ve diğer bazı pıhtılaşma faktörleri azalır. BU DA APTT VE PT’NİN HATALI OLARAK UZUN BULUNASINA NEDEN OLUR. İnvitro pıhtı oluşumu trombosit aktivasyonuna ve granül salınmasına yol açar; Travmatik flebotomi, hemostaz sisteminin (PF4) parsiyel aktivasyonuna neden olarak pıhtılaşma zamanının hatalı şekilde kısalmasına neden olur KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK (KAN) ALMAK Kan tüpe alındıktan sonra 3-6 kez çevrilmek suretiyle alt üst edilmeli; örnek kesinlikle çalkalanmamalıdır. Örnek tüpünde pıhtı bulunması örneği laboratuvar tarafından KESİN ret sebebidir. Tüp içerisinde çıplak gözle görülmeyen pıhtıların da bulunabileceğine ayrıca dikkat edilmelidir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ İğne Kalınlığı (gauge) 19-22 G genellikle optimum kalınlık olarak kabul edilir. 25 G’den büyük olanlar kan akımının yavaşlamasına, 16 G’den küçük olanlar da akım türbülansına bağlı hemolize neden olacağından bu tür testlerin örnek alımında kullanılmamalıdır. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Kan alım tüpünün özellikleri Cam gibi negatif yüklü yüzeyler ile koagülasyon faktörlerinin teması sonucu ‘fibrin’ meydana gelir (kontakt aktivasyon). Bu nedenle hemostaz testlerinde kullanılacak primer veya sekonder (vs.) tüplerin polipropilen plastik veya silikon kaplı cam gibi maddelerden yapılmalı. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Kan alım tüpünün özellikleri Kan alımı sırasında şırınga pistonuna uygulanan aşırı basınca bağlı parçalama (shear) etkisine bağlı hemoliz ve kan/antikoagülan oranının tutturulamaması ihtimali nedeniyle enjektörle kan alınması tavsiye edilmez. Ancak kaçınılmaz ise alınmış kan örneği ile antikoagülan madde örneğin alınmasını takiben 30 saniye içinde karıştırılmalı. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Antikoagülan Cins ve Konsantrasyonu Hemostaz testlerinde uygun olan Na sitrat. %3,8’lik Na-sitratlı tüpler ile pediatrik tüpler örneğin az olmasına bağlı etkilere daha açık. %3,8’lik tüplerle PT ve a PTT ref aralıkları %3,2’lik tüpe göre daha uzun, KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Antikoagülan Cins ve Konsantrasyonu CBC örnekleri için tercih edilmesi gereken K2-EDTA içerenlerdir. Ancak trombositler EDTA ile aktiflendiklerinden, özellikle trombositler analiz edilecekse CTAD’lı tüpler tercih edilmeli. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Antikoagülan Cins ve Konsantrasyonu Heparinli tüplerde Faktör aktivitesi tayinleri oldukça düşük bulunur. EDTA veya heparinli tüplerle yapılan PT a PTT testleri çok uzamış bulunur (no clot detected), Serumda F-VII ve F-IX’un cok fazla artar, F-V ve F-VIII’in düşer. Referans laboratuvarlara gönderilen donmuş plazma örneklerinin sitratlı örnek dışında örnekler olabileceğine dikkat edilmelidir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Sodyum Sitratlı Özel Tüpler Trombosit aktivasyonunu engelleyenler Sitrat, teofilin, adenozin, dipiridamol (CTAD) karışımı, invitro trombosit çalışmaları için; bu tüpler özellikle ışıktan korunarak, soğukta saklanmalıdır. PF4 etkisini azalttığı için UFH ölçümlerinde kullanılır KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Sodyum Sitratlı Özel Tüpler Trombosit aktivasyonunu engelleyenler FXa analizi için standart sodyum sitratlı tüp kullanıldığında (aktivite 4 saatte %50 azalır) analizin kan alınmasını takiben bir saat içinde yapılması şarttır. Oysa CTAD içeren tüplerde bu süre dört saate kadar uzayabilir. CTAD’lı tüpler ayrıca PF4 ve β-TG gibi trombosit aktivasyonu belirteçleri ile PAI-1 tayini için kullanılır. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

HATALI ANTİKOAGÜLAN KULLANILMASI KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Sodyum Sitratlı Özel Tüpler Fibrinolitik sistem faktörlerini stabilize etmek için asidifiye olanlar Proteaz inhibitörü içerenler (Phe- Pro-Arg-klorometilketon [PPACK] Özel sitratlı tüpler kullanılarak rutin hemostaz testleri yapıldığında yeni referans aralıkları belirlenmelidir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Kan/Antikoagülan Oranı: Kan/sodyum sitrat oranı 9/1 olmalıdır. %3,8’lik Na-sitratlı tüpler ile pediatrik tüpler az kan örneğinin az olmasına bağlı etkilere daha açık, Yüksek rakımda vakumlu tüplerin doluşunun etkilenir. Farklı vakumlu tüplere alınmış olan örneklerin birbiri ile kesinlikle karıştırılmaz. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Alma Sİstemİ Kan/Antikoagülan Oranı: Kan/sodyum sitrat oranı 9/1 olmalıdır. Hastanın Hct değeri %55’ten fazlaysa ayarlama yapılması gerekir. (Kabaca 0,1 µL Na sitrat at) C=0,00185*(100H)*V C=ml cinsinden Na sitrat %3,2; H=Hct; V=ml cinsindan kan hacmi KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Turnİke KullanIlmasI Turnike 1 dakikadan fazla sıkılmış bırakılmaz. Turnikenin üçüncü dakikasından sonra: PT %3,1 kısalır, fibrinojen %10,1 artar, D dimer %13,4 artar, F VII aktivitesi %10,6 artar, F VIII aktivitesi %10,2 artar Trombin oluşturma belirteçleri (TAT kompleksi) ve protrombin fragman 1,2 gibi özel pıhtılaşma testleri için alınacak örneklerde turnike hiç kullanılmamalı. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Discard Tüp KullanIlmamasI Çok sayıda vakumlu tüpe kan alınacaksa koagulasyon tüpü ilk tüp olmalı. Sadece koagulasyon için kan alınacaksa discard tüpü gereksiz. Özel koagulasyon testleri için discard tüpüne gereksiz. Katkı maddesi içeren tüplerden (örneğin EDTA) sonra koagulasyon tüpüne kan alınmaz. Kelebek set gibi bir sistem kullanıldığında setin ölü hacmi kadar kan discard tüpüyle alınır. Serum seti gibi bir düzenekten kan alınmaz. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK TRANSPORTU Örnek, laboratuvara oda sıcaklığında nakledilir Tüp kapağı kapalı olmalı. Pnömatik sistemle nakledilebilir. Ancak bu hat içerisinde aşırı vibrasyon veya sert darbeli hamleler (sert dönüşler) bulunmamalı. Trombosit fonksiyon testleri için kullanılacak örnekler pnömatik sisteme konmaz. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Kan Örneğİne Soğuk Etkİsİ (BuzdolabI) Soğukta Trombositler ile FVII aktiflenir, FVIII ile vWF önemli miktarda azalır. (Hatalı Hemofili A veya vWD tanısı) vWF aktivitesi vWF antijeninden daha fazla etkilenir. Santrifüj edilmeden önce kan örneğinin ısıtılmasıyla bu aktiviteler kısmen geri gelir (tercih edilmez) KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

ÖRNEK İŞLEME Santrifüj Oda sıcaklığında; 1500xg; en az 15 dk. LA, APA, APCR testleri, UFH takibi, veya örnek dondurulacaksa PPP çok önemli. Santrifüj süresi PT ve aPTT’de az önemli Filtrasyon (Micropore; 0,2 µm) kullanılmamalı. Trombositlerin yanı sıra FV, VIII, IX, XII, vWF kaybolur; (hemofili A ve vW hst. yanlış tanısı) PT ve aPTT uzar. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Hemolİz, Lİpemİ, İkter Optik end-point analiz yöntemi kullanıldığında bu etmenler test sonucunu etkiler. Bu nedenle bu durumlarda mekanik ve/veya elektromekanik yöntemler kullanılmalıdır. HEMOLİZE ÖZEL DİKKAT! Hemoliz sonucu açığa çıkan eritrosit membranları plazmanın aktiflenmesine ve koagulasyon parametre-lerinin değişmesine yol açar. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Hemolİz, Lİpemİ, İkter İnvitro hemoliz sebepleri: Antekübital fossanın distalindeki damardan kan almak Uzun süre turnike uygulaması Travmatik damar uygulaması Uygun olmayan iğne kullanımı Enjektör kullanılması Plazmanın hücrelerle uzun süre teması Örneğin sıcağa maruz kalması Mekanik travma KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

PLAZMA ÖRNEKLERİNİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Plazma örneği ayrılırken buffy coat bütünlüğü bozulmaz. Saklama sırasında tüp kapakları çıkarılmaz. PT testi örneği alınmasını takiben plazması ayrılmış örnekte 24 saate kadar yapılabilir. aPTT testinin 4 saat içinde yapılması gerekir. UFH içerebilecek örneklerin bir saat içinde plazmasının ayrılması gerekir. Bundan sonra analizin dört saatte tamamlanması gerekir. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

PLAZMA ÖRNEKLERİNİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Protein S aktivitesi oda sıcaklığında sekiz saatte ciddi miktarda kaybolur. Fibrinojen, Protein C ve AT aktivitesi oda sıcaklığında 7 güne kadar nispeten sabit kalır. Dondurulmuş örnekler çözüldükten sonra tekrar dondurulmaz. Uzun süreli saklamak için plazma örnekleri -20°C iki hafta kadar dayanır. Daha uzun saklamak için -70°C veya daha soğuk ortamlar kullanılmalıdır. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

Donmuş Plazma Örneklerİnİn Çözülmesİ Donmuş örnekler 37°C su banyosunda 5 dakikada çözülür, (örnekler tamamen çözülmezse veya 37°C çok fazla tutulursa analiz sonucu bozuk çıkar.) F VIII, vWF ve fibrinojen soğukta presipite olur, (yeterince çözülmemiş örneklerde kriyopresipitat nedeniyle düşük bulunurlar) Çözülmüş örnekler analizden önce iyice karıştırılmalı. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

CBC Örneğİnİn Bekletİlmesİ İLE KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

EN SIK PREANALİTİK HATA KAYNAKLARI Na sitrat dışı antikoagülan kullanımı Vakumlu tüpün yetersiz doldurulması Yetersiz doldurulmuş Na sitratlı tüpe başka tüpten kan aktarılması Tüpün yetersiz karıştırılması Kan örneğinin soğukta saklanması Örneğin laboratuvara geç ulaştırılması KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

HEMOSTAZ TESTİ İÇİN İDEAL ÖRNEK Minimal turnike kullanımıyla atravmatik flebotomiyle örnek alınmış, Tercihan %3,2’lik mavi kapaklı tüpe öncelikle veya katkısız tüpten sonra kan alınmış, Tüp yeterli doldurulmuş (>%90<%105), Kan alındıktan sonra uygun/yeterince karışmış, Oda sıcaklığında süratle transport edilmiş, Kan alımını takiben 1 saat içinde santrifüj olmuş, Santrifüjden sonra plazma örneği uygun sekonder tüpe alınmış örnek. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

NUMUNE RED KRİTERLERİ Na sitrattan başka antikoagülan kullanılmış olanlar, Pıhtı içerenler, Kan/antikoagülan oranı 9/1 olmayan, %90’dan az doldurulmuş veya, Aşırı dolu tüp, Hct>%55, Hemolizli örnekler. KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

EK-1 TT (Trombin Zamanı) Hatalı Uzamasının Nedenleri: Disfibrinojenemi FDP ve paraprotein yüksekliği Amiloidoz Heparin like antikoagülanlar (maligniteler) FDP ve D-dimer Hatalı Yüksekliği Nedeni: RF yüksekliği KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

EK-2 Platelet Fonksiyon Testinin Hatalı Sonuç Nedenleri: Hiperlipidemi Hemoliz Trombositopeni Faktör Analizinin Hatalı Düşüklük Nedenleri: Heparin Lepirudin Danaparoid Argatroban KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

EK-3 Hatalı Pozitif LA Testinin Hatalı Pozitiflik Nedenleri Heparin Lepirudin Danaparoid Argatroban KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT

SABRINIZ İÇİN TEŞEKKÜR EDERİM KBUD-BD 22 MART 2014 ABANT