TIBBİ MİKROBİYOLOJİ

Mikroorganizmalar protista (tek hücreli hayvan veya bitki) aleminin üyesidirler. Bakteriler, mantarlar, protozoonlar ve helmintleri içerirler. Protistalar prokaryot ve ökaryot olarak iki gruba ayrılırlar. Bakteriler prokaryotik hücre yapısına sahipken, mantar ve protozoonlar (tek hücreli en küçük hayvan organizmaları) ökaryotik yapıdadır. Helmintler hayvanlar alemine dahildir. Virüsler tamamen farklı bir gruptur. Bunlar hücre değilse de sadece hücrelerin içinde çoğalırlar. Işık mikroskobunda görülmezler. En küçük enfeksiyöz partiküllerdir.

Ökaryotik hücre nükleusu, nükleer membran aracılığı ile sitoplazmadan ayrılmıştır. Ökaryotik hücre sitoplazmasında lizozom, ER, ribozom ve golgi aygıtı bulunur. Prokaryotların belirgin bir çekirdek yapıları ve çekirdek membranı yoktur.

Tıbbi açıdan önemli mikroorganizmaların karşılaştırılması Özellikler Virüsler Bakteriler Mantarlar Protozo onlar Hücre --- Var Ortalama ölçüler (nm) 0.02-0.2 1-5 3-10 15-20 protozoon Nükleik asit DNA veya RNA DNA+RNA RNA+RNA Çekirdek tipi Yok Prokaryotik Ökaryotik Ribozom Mitokondri Hareket Bazılarında var Pekçoğunda var

Laboratuvara kültür/antibiyogram için gelen başlıca numuneler Boğaz Kulak Burun Yara İdrar Gaita Sonda Vajen Akıntı Mantar Mayi Balgam BOS Swap testi

Boğaz kültürü Eküvyonda gelen boğaz kültürleri, 1 adet koyun kanlı petri plağına, tek koloni düşürme metodu ile ekilir. 37 °C’de 24-48 saat aerob etüvde inkübe edilir.

İdrar kültürü Steril kapta gelen idrar hiç vakit kaybetmeden 2’li petri plağına (koyun kanlı, EMB) veya 3’lü petriye (koyun kanlı, insan kanlı, EMB) iç çapı 0,5 mm olan öze ile ekilir. Ekim yapılırken öze dik olarak batırılır ve özenin bu konumda aldığı idrar 10 μl’dir. Bu işlem steril pipet ucu ile 10 μl çekilerek de yapılabilir. 2’li petri aerob ortamda, 24-48 saat inkübe edilir. Santrifüj işlemi yapılmamış steril idrardan bir öze dolusu idrar örneği ile lam üzerinde preparat hazırlanır. Kurutulur ve gram boyama yapılır. Gelen örnekteki lökosit ve eritrosit sayısı neubauer lamında değerlendirilir veya santrifüj işlemi sonrası lökosit ve eritrosit sayısı not edilir.

Gaita kültürü Gelen örnek makroskobik ve mikroskobik yönden değerlendirilir ve kültür defterine not edilir. Salmonella ve shigella izolasyonu için numune bekletilmeden koyun kanlı, EMB ve XLD besiyerine ekilir. Aerob koşullarda 37 °C’de, 24-48 saat inkübe edilir. 10 g kadar da GN Broth (selenit) sıvı besiyeri tüpüne alınır. Üzerine hasta bilgileri yazılarak aerob koşullarda 37 °C’de bekletilir. 6-8 saat sonra bir başka XLD besiyerine tek koloni düşürmek amacıyla ekim yapılır (pasaj). Diğer petrilerle beraber değerlendirilir.

Gaita kültürü Campylobacter spp izolasyonu için, özellikle mikroskobisinde çok sayıda eritrosit görülen (beraberinde lökosit görülen) numunelere, diğer işlemlere ilaveten campylobacter besiyerine ekilir, etrafı parafilmle kapatılıp % 10 CO2’li ortamda inkübe edilirler.

Vajen kültürü Vajinal sürüntü örnekleri direk mikroskobi ile birlikte değerlendirildikleri için iki ayrı eküvyon olmalıdır. Materyal hiç vakit kaybetmeden 3’lü petriye ( koyun kanlı, modifiye Thaer-Martin, EMB) ekilir.3’lü petri % 10 CO2’li ortamda 24-48 saat inkübe edilir. Aynı eküvyon ile diamond besiyerine ekim yapılır ve 48-72 saat içinde her gün üreme kontrolü yapılarak inkübe edilir. Direk mikroskobi için gönderilen diğer eküvyon, 40’lık objektif ile candida ve trichomonas vaginalis, lökosit ve epitel, cluecell yönünden incelenir. Ekimlerden sonra gram ve giemsa ile boyalı preparatlar hazırlanır.

Balgam kültürü Gelen örnek ışık mikroskobunda x100 büyütmede incelenir. Epitel sayısı bu büyütme alanında 10 adetten fazla, lökosit sayısı 25 adetten az olan örnekler, tükürükle kontamine olmuş kabul edilip reddedilir. Materyalin en mukoid ve pürülan (iltihaplı görünümlü) görülen kısmından öze ile alınarak 3’lü petri plağına (koyu kanlı, çikolatamsı, EMB) ve bir adet saboraud besiyerine ekilir. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir. Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü protokolu uygulanır. Ekimlerden sonra gram ve giemsa boyalı preparatlar hazırlanır.

Kateter ve sondalar Kateter; Damar içi kateter ve endotrakeal-trakeostomi tüpleri içinden aspirasyon yapılmış kateterlerin hiç vakit kaybetmeden 3’lü petriye (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekimi yapılır. Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü protokolu uygulanır. Aynı materyal 2 ml %0.9 NaCl ile yıkanır. İşlem sonunda 10 μl alınarak, 3’lü petriye (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekimi yapılır. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir. Ekimlerden sonra gram, giemsa ile boyalı preparatlar hazırlanır.

Sondalar; İdrar sondaları hiç vakit kaybetmeden 2’li petri plağına (koyun kanlı, EMB) veya 3’lü petriye (koyun kanlı, insan kanlı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekilir. Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü protokolu uygulanır. Aynı materyal 2 ml %0.9 NaCl ile yıkanır. İşlem sonunda 10 μl alınarak, 2’li petriye (koyun kanlı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekimi yapılır. 2’li petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir. Hastanın aynı gün idrar örneğinin gelip gelmediği araştırılıp gelmemiş ise idrar kültürü için steril idrar örneği istenir. Ekimlerden sonra gram, giemsa ile boyalı preparatlar hazırlanır.

Eküvyonda gelen yara, abse ve pü kültürleri Gelen eküvyon 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ve bir adet saboraud besiyerine ekilir. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir. Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü protokolu uygulanır. Ekimlerden sonra gram, giemsa ve metilen mavisi ile boyalı preparatlar hazırlanır.

BOS kültürü Gelen örnek makroskobik olarak değerlendirilir. Kanlı, pürülan vs. olup olmadığı not edilir. Bekletilmeden 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ve bir adet saboraud besiyerine ekilir. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir. Zenginleştirme besiyeri olarak kan kültürü besiyeri kullanılabilir. Pediatrik kan kültürü şişesine 1-3 ml aktarılır ve kan kültür cihazına yerleştirilir. Ekimlerden sonra gram, giemsa ve metilen mavisi ile boyalı preparatlar hazırlanır.

BOS kültürü Gelen örneğin neubauer veya thoma sayım kamaralarında, lökosit ve eritrosit sayımları yapılır. Kalan BOS örneği steril şartlarda 3000 rpmde 5 dk santrifüj edilir. Eğer tek tüp numune geldiyse süpernatan biyokimyasal çalışmalar için kullanılır. Sedimentten gram, giemsa ve metilen mavisi ile boyalı preparatlar yeniden hazırlanır. Bir miktar BOS sterilitesini korunarak 2-8 °C’de saklanır.

Kan kültürü Kan kültürü şişelerinin üzerinde cihazın okuduğu barkod, numunenin alındığı gün, saat yazılmış mı diye kontrol edilir. Numuneler Bactec 9050 cihazına yüklenir. Aerob, Anaerob, Ped’s Plus vesiyeri içine alınan örnekler 7 günlük inkübasyonlarının ardından cihazdan manuele uygun çıkartılırlar. Bu şişeler negatif numune olarak kabul edilir ve gram boyalı preparatları hazırlanır. Boya değerlendirmesinde mikrooranizma görülür ise gerekli sayıda 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ekilir.

Kan kültürü İnkübasyonları sırasında, pozitif alarm veren şişeler, cihazdan manuele uygun çıkartılırlar. Materyal hiç vakit kaybetmeden Aerob ve Ped’s Plus şişe ise 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ekilir, % 10 CO2’li ortamda 48 s inkübe edilir. Eğer Anaerob şişe ise 2 adet 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB) ekilir. Petrilerden biri aerob koşullarda inkübe edilirken diğeri anaerobik jara kaldırılır, 48 s inkübe edilir. Bir lam üzerinde gram boyalı preparatlar hazırlanır.

sterilizasyon Herhangi bir ortamda bulunan bütün canlı organizmaların öldürülmesi veya uzaklaştırılması olarak tanımlanır. Mikrobiyoloji için çok önemlidir. Çünkü mikrobiyolojideki deneyler saf kültürle gerçekleştirilir. Steril şartlar yerine getirilmemişse, istenmeyen mikroorganizmalar (kontaminantlar) gelişecek ve elde edilen sonucun hangisine ait olduğu anlaşılamayacaktır. Sterilizasyon tüpleri: sıcaklık kullanılarak (direk alevle, kuru sıcaklıkta, nemli sıcaklıkta) kimyasal radyasyonla filtrasyonla

Sıcaklıkla sterilizasyon Direk alevle sterilizasyon: Alevle direkt olarak yakma ile yapılan en basit sterilizasyon tipidir. Öze ve cam malzemelerin açık ağızları gibi sıcaklıktan etkilenmeyen malzemeler bu yöntemle sterilize edilirler. Kuru sıcaklıkla sterilizasyon: Sıcak hava fırınlarında yapılan sterilizasyondur. Genelde 175 °C’de 1 saat şeklinde yapılır. Petri kutusu, erlen, beher, mezür gibi boş cam malzemeler için kullanılır. Nemli sıcaklıkla sterilizasyon: En çok kullanılan yöntemdir. Sıcaklığı 100 °C’nin üzerine çıkarılmayan sıvıların basınç yardımıyla 121 °C’de 15 dk şeklinde, otoklavlar yardımıyla sağlanır. Besiyerleri için kullanılır.

Kimyasal sterilizasyon Isıya duyarlı katı malzemelerin sterilizasyonu kimyasal maddelerle yapılır. En yaygın olanı etilenoksittir, bu madde protein ve nükleik asitleri inaktive eder ve mikroorganizmaları öldürür. Plastik petri, şırınga gibi malzemeler için kullanılır.

Radyasyonla sterilizasyon Isıya duyarlı katı malzemelerin sterilizasyonu için Bazen kimyasal str. yerine bu yöntem kullanılır. Genelde radyoaktif kobalt-60 veya sezyum-139’dan elde edilen gama radyasyonu uygulanır. Gama radyasyonu hücredeki su moleküllerine etki ederek serbest radikal oluşuma neden olur. Oluşan bu serbest radikaller, oldukça reaktiftirler ve başta enzim ve nükleik asitler olmak üzere hücredeki birçok molekülün bozulmasına neden olur. Plastik maddeler bu yolla sterilize edilebilirler.

Filtrasyonla sterilizasyon Vitamin ve antibiyotik gibi ısıya duyarlı maddelerin ve gazların sterilizasyonu için kullanılır. Günümüzde çoğunlukla membran filtreler kullanılır. Bu filtreler değişik delik çaplarına sahiplerdir. Bakteriler için genelde 0,45 μm delik çapına sahip olan filtreler kullanılır. Sterilize edilecek sıvı, enjektör yardımıyla filtreden geçirilir. Bu esnada sıvıda bulunan mikroorganizmalar filtreden geçemezler ve yüzeyde kalırlar, sıvı steril elde edilmiş olur.

mikrobiyolojide besiyerleri Mikroorganizmaları üretmek için kullanılan besin karışımına besiyeri denir. Üretmek istenilen mikroorganizmaya göre değişik şekillerde hazırlanır. Besiyeri kabaca katı, yarıkatı ve sıvı şeklinde gruplandırılır. Katı besiyerinde % 1,5-2, yarıkatı besiyerinde % 0,75 oranında agar vardır. Tek koloni elde etmek için kullanılır. Sıvı besiyerinde agar bulunmaz, homojen üretimde kullanılır.

‘Genel besiyeri’ birçok mikroorganizmanın gelişimine uygundur ‘Genel besiyeri’ birçok mikroorganizmanın gelişimine uygundur. Mikroorganizmaların genel üretimi ve saklanması için hazırlanır. ‘Ayırıcı besiyeri’, istenen mikroorganizmayı geliştiren diğerlerini yok eden besiyeridir. Ayırıcı besiyeri, antibiyotik, boyalar veya tuz ilavesiyle seçici hale gelir. Örneğin, nutrient agar (NA), yüksek tuzlu agar (YTA) ve mannitol tuz agar (MTA). NA, genel amaçlı, seçici ve ayırıcı olmayan bir besiyeridir ve en yaygın olarak kullanılanıdır.

Yüksek tuzlu agar (YTA), % 7,5 oranında NaCl içerir ve birçok mikroorganizma bu tuz konsantrasyonunda gelişmezken sadece Staphylococcus cinsi gelişme gösterir. Bu nedenle seçici besiyeri olarak tanımlanır. Mannitol tuzlu agar (MTA), hem ayırıcı hem de seçicidir. % 7,5 oranında NaCl içerir, bu yüzden seçicidir. Fenol ve mannitol içerdiğinden de ayırıcıdır. Bakteri ancak tuza toleransı varsa gelişebilir. Gelişebilenlerden bazıları, mannitolu fermente ederse kolonilerin etrafındaki pH düşer ve fenolün rengi pembeden sarıya döner. Staphylococ aureus gibi pek çok patojen safilokok mannitolu fermente ederlerken, patojen olmayan ve insan derisinde bulunan s.epidermidis mannitolu fermente etmez. Bu şekilde stafilokoklar ayrılmış olur.

Besiyerinde bulunması gereken maddeler: su karbon kaynağı enerji kaynağı azot kaynağı mineral maddeler gelişme faktörleri hidrojen iyonu konsantrasyonu boya madeleri antibiyotikler agar

Besiyerlerinin hazırlanması Nutrient agar besiyeri Genel kullanım amaçlı bir besiyeri olup kan veya diğer biyolojik sıvılar eklenerek zenginleştirilir. Lab-Lamb powder 1 gr Yeast extract 2 gr Peptone 5 gr Sodium chloride 5 gr Agar 15gr 28 gr besiyeri 1000 ml distile suda çözülür. Kaynatarak tamamen çözünmesi sağlanır. 121 °C’de 15 dk sterilize edilir Staphylococcus aureus: iyi gelişir, saman renkli/beyaz koloni Escherichia coli: iyi gelişir, saman renkli koloni

S. aureus Kanlı agarda s. aureus

S. aureus mannitol tuzlu agarda

Staphyococcus antibiyogramı

E.coli

E.coli EMB de      E.coli on blood plate

E. coli antibiyogramı