Ghrelin ve Oreksin Reseptör Agonistlerinin Morfin Analjezisi ve Toleransı Üzerine Etkileri Tayfun BAŞER Cumhuriyet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Fizyoloji Anabilim Dalı Temmuz, 2018

opium İnsanoğlunun ızdırabını dindirmek için mevcut çareler arasında hiçbirisi opium kadar evrensel ve etkili değildir. Thomas Sydenham, 1682

GİRİŞ Ağrı kompleks mekanizmalar tarafından oluşturulan ve yaşam kalitesini düşüren psikolojik ve fizyolojik bir yaşantı olarak tanımlanır. Ağrının giderilmesi için geçmişten süre gelen birçok fizyolojik deneysel çalışmalar yapılmıştır. Bunun neticesinde ağrı üzerinde analjezik etki yaratan opiyatların keşfi, ağrı tedavisinde yeni yaklaşımların doğmasını sağlamıştır. Keşfedilen opiyatlardan en yaygın olarak kullanılanı morfindir.

GENEL BİLGİLER Ağrı Nörofizyolojisi Ağrılı uyaran transdüksiyon aşamasında elektriksel sitimulusa dönüştürülür. Transmisyon aşamasında elektriksel sitimulus A-delta ve C lifleri ile üst merkezlere iletilir. Modulasyon aşamasında medulla spinaliste değerlendirilen noksiyöz stimulus son aşama persepsiyonda algılanır ve yanıt oluşturulur

GENEL BİLGİLER Ağrı Yolakları Dorsal boynuz laminalarına gelen ağrılı uyaranlar; spinotalamik yolak, spinoretiküler yolak, spinomezenfalik yolak, spinoservikal yolak ve dorsal kolon yolakları ile limbik sistem ve serebrum korteksine iletilir

GENEL BİLGİLER Ağrının Sınıflandırılması

GENEL BİLGİLER Ağrı Teorileri Spesifite Teorisi Yoğunluk TeorisiPattern Teori

GENEL BİLGİLER Ağrı Teorileri Kapı Kontrol Teorisi Herhangi bir noksiyöz uyarı olmadıkça dorsal boynuzdaki T hücresi sürekli inhibe haldedir. Kapı kontrol teorisinde kapı fonksiyonu olan substansia gelatinoza (SG) noksiyöz uyarı neticesinde açılarak T hücresi aktifleşmesini sağlar ve ağrı sitimulusu SSS’ye iletilir.

GENEL BİLGİLER Endojen Opioid Sistem Endojen opioid sistem reseptör ve peptid gruplarından oluşmaktadır.

GENEL BİLGİLER * Morfin, analjezik etkisini yapısında bulunan alkoloidler sayesinde göstermektedir. Mü reseptörlerine karşı yüksek bir afinitesi olan morfin analjezik etkisini kalsiyum kanal blokörlerini aktive ederek ve adenilat siklazı inhibisyonu ile gerçekleştirmektedir. * Uzun süreli morfin kullanımı fizyolojik olarak çeşitli yan etkiler oluşturmaktadır. Solunum depresyonu, konstipasyon, bağımlılık, bulantı ve kusma gibi yan etkiler bu etkilerden bazılarıdır. Morfin

GENEL BİLGİLER Morfin Analjezi Mekanizması Morfinin mü reseptörlerine bağlanmasıyla medulla spinaliste K + çıkışında artma ve dorsal boynuzda Ca 2+ de azalma meydana gelmektedir. Dorsal boynuzdan salınan P maddesinin Ca 2+ azalmasına bağlı olarak inhibisyonu ile analjezi gerçekleşir.

GENEL BİLGİLER * Morfinin uzun süreli kullanımı ile analjezik etkisine karşı tolerans gelişmesine neden olur. Morfine karşı tolerans gelişmesi, kronik olarak alınan opiyatın ağrı kesici etkisinin sürekli olarak azalması ve aynı etkiyi oluşturmak için daha yüksek dozda alınmasını gerektirmesi olarak tanımlanır. * Sürekli morfin alımıyla gerçekleşen fizyolojik reaksiyonlar sonucu oluşan adaptasyon ve ilgili opiyat reseptörlerin duyarsızlaşması, karmaşık olan tolerans mekanizmasını açıklamaya çalışan yaklaşımlardır. Morfin Toleransı

GENEL BİLGİLER Morfin Tolerans Mekanizması Morfin tolerans mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmış değildir. Ancak nasıl gerçekleştiğine dair bazı yaklaşımlar şunlardır; a) Siklik adenozin monofosfat (cAMP) yolaklarının üst düzenlemesi, b) Alfa-2 nöradrenerjik sistemler, c) Sinyal iletimi sırasında protein-kinaz bağımlı nöroadaptif değişiklikler d) NO ve siklik guanozin monofosfat (cGMP) indüksiyonu

GENEL BİLGİLER * Midenin oksintik mukozasının yanı sıra hipotalamustandan da salgılanabilen ghrelin; besin alımını artırma, inflamasyon öncesi sulanmayı önleme gibi fizyolojik fonksiyonlara sahiptir. Ghrelin genel olarak agonist olarak bağlandığı reseptörler aracılığıyla ağrı üzerinde kısa süreli de olsa analjezik etki gösterebilmektedir. Aynı zamanda ghrelin ve onun yapay formları morfinin analjezik etkisini artırmaktadır. Ghrelin

GENEL BİLGİLER Ghrelin GHS-R1α reseptörüne bağlanarak fizyolojik fonksiyonlarını yerine getirir GHS-R1α reseptörü G proteinlerinden oluşur ve adenilat siklaz enzim inhibisyonunda önemli rol oynar GHS-R1α reseptöründeki etkileşimler protein-kinaz (PKC) yolakları sayesinde gerçekleşmektedir Ghrelin Reseptörü

GENEL BİLGİLER Oreksinler hipotalamustaki oreksinerjik nöronlardan salgılanır. İştah düzenlemesi, nöroendokrin fonksiyonlar, ağrı modülasyonu ve analjezik etkinlik gibi fizyolojik mekanizmalarda görev alan oreksinler nöropeptid yapıdadırlar. Oreksin-A ve oreksin-B olmak üzere bilinen iki formu bulunan oreksinlerin salgınlandıkları bölgeler ve etki mekanizmaları göz önünde tutulduğunda nosiseptif süreçlerle ve ödül merkeziyle ilişkisi oldukları düşüncesi ağır basmaktadır. Oreksin

GENEL BİLGİLER Oreksinler OX1r ve OX2r reseptörlerine bağlanarak fizyolojik aktiviteleri gerçekleştirirler OX1r ve OX2r reseptörleri G eşlemeli proteinlerden oluşmaktadır Oreksin-A ve öreksin-B her iki reseptöre de bağlanabilir ama öreksin- B’nin OX2r reseptörüne olan seçiciliği yaklaşık 10 kat daha fazladır Oreksin Reseptörleri

AMAÇ Bu tez çalışmasının amacı, ghrelin peptidinin sentetik formu olan hexarelin ile önemli nöropeptidlerden olan oreksin-A ve oreksin-B’nin morfin analjezisi ve toleransına etkilerini araştırmaktır Araştırmadan elde edilecek sonuçlar ghrelin ile oreksin reseptör agonistlerinin morfin analjezi ve toleransına etkileri ile ilgili önemli bilgiler sunacaktır

GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmada strese maruz kalmamış ve standarda uygun kafeslerde bakılan erişkin 126 adet Wistar Albino sıçan kullanılmıştır. Cumhuriyet Üniversitesi Hayvan Laboratuarından elde edilen her biri 6-8 aylık ve yaklaşık gram ağırlığında olan sıçanlar 22±2 o C oda sıcaklığında, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngünün sağlandığı, sesten yalıtılmış odada ve %53±5 bağıl nem oranına sahip ortamda tutulmuştur. Deney Hayvanları

GEREÇ VE YÖNTEM Sıra No Deney ve Kontrol Grupları Hayvan Sayısı (n) 1Salin6 2Morfin6 3Morfin Tolerant6 4Hexarelin (GHS-R1α agonisti)6 5GHRP-6 (GHS-R1α antagonisti)6 6Oreksin-A (OX1r agonisti)6 7Oreksin-B (OX2r agonisti)6 8SB (OX1r antagonisti)6 9TCS OX2 29 (OX2r antagonisti)6 10Hexarelin+Morfin6 11GHRP-6+Morfin6 12Oreksin-A+Morfin6 13Oreksin-B+Morfin6 14TCS OX2 29+Morfin6 15SB Morfin6 16Hexarelin+Morfin Tolerans6 17GHRP-6+Morfin Tolerans6 18Oreksin-A+Morfin Tolerans6 19Oreksin-B+Morfin Tolerans6 20SB Morfin Tolerans6 21TCS OX2 29+Morfin Tolerans6 Toplam Hayvan Sayısı126

GEREÇ VE YÖNTEM Kimyasallar ve Uygulama Şekilleri Ghrelin reseptör ligandları *Hexarelin (GHRP-2): 10 mg/kg *GHRP-6: 0.5 mg/kg, i.p. Oreksin reseptör ligandları *Oreksin-A: 10 μg/kg, i.p. *SB : 10 mg/kg, i.p. *Oreksin-B: 15 μg/kg, i.p. *TCS OX2 29: 0.5 mg/kg, i.p. Morfin: 5 mg/kg, s.c. İntraperitonal Uygulama (i.p.) Subkutan Uygulama (s.c.)

GEREÇ VE YÖNTEM Termal Analjezi Ölçümü Tail Flick Testi Hot Plate Testi

GEREÇ VE YÖNTEM Morfin Tolerans İndüksiyonu Morfine karşı tolerans geliştirilmesi için daha önce yapılmış çalışmalar referans alınarak, sıçanlara subkutan olarak 3 gün süre ile günde 2 defa 60 mg/kg morfin sülfat enjekte edilmiş ve 4. gün tek doz morfinden sonra tolerans değerlendirilmesi yapılmıştır. Morfin, test dozu olan 5 mg/kg dozunda hayvana verilerek analjezik etki Tail-Flick ve Hot Plate testleri ile ölçülmüştür.

GEREÇ VE YÖNTEM Verilerin Analizi ve İstatistiksel Değerlendirme Deneysel sonuçlar ort±SH (ortalamanın standart hatası) olarak ifade edilmiştir. Analjezik etkinlik, tüm gruplarda ölçülen %MPE değerlerinin ortalaması alınarak değerlendirilmiştir. *

GEREÇ VE YÖNTEM Verilerin Analizi ve İstatistiksel Değerlendirme Deney gruplarının 15, 30, 60, 90 ve 120. dakikalardaki %MPE değerleri hesaplanmıştır Veriler varyans analizi (ANOVA) ile test edilmiş ve daha sonra gruplar arası farkın hangi gruptan kaynaklandığı Tukey testi (post- hoc test) ile belirlenmiştir. İstatistiksel anlamlılık p ˂ 0.05 düzeyinde tanımlanmıştır.

BULGULAR Hexarelin ve GHRP-6’nın Morfin Analjezisi Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında, **p<0,05 morfin grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

BULGULAR Oreksin-A ve SB ’nin Morfin Analjezisi Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

BULGULAR Oreksin-B ve TCS OX2 29’un Morfin Analjezisi Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında, **p<0,05 morfin grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

BULGULAR Hexarelin ve GHRP-6’nın Morfin Toleransı Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında, **p<0,05 morfin tolerans grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

BULGULAR Oreksin-A ve SB ’nin Morfin Toleransı Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında, **p<0,05 morfin tolerans grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

BULGULAR Oreksin-B ve TCS OX2 29’un Morfin Toleransı Üzerine Etkileri Analjezik etkiler % MPE ve veriler ort. ± SH olarak ifade edilmiştir. *p<0,01 salin grubuna göre karşılaştırıldığında, **p<0,05 morfin tolerans grubuna göre karşılaştırıldığında (Her bir grup için n= 6).

TARTIŞMA Çalışmamızda elde ettiğimiz bulgulara göre; Hexarelin morfin analjezisini anlamlı bir şekilde artırmaktadır Oreksin-B morfin analjezisini anlamlı olarak azaltmaktadır Oreksin-A morfin analjezisi üzerinde anlamlı bir etki göstermemiştir Hexarelin morfin toleransını anlamlı olarak azaltmaktadır Oreksin-B morfin toleransını azaltmaktadır Oreksin-A antagosniti SB morfine karşı gelişen tolerans üzerinde anlamlı bir azaltıcı etki göstermektedir

TARTIŞMA vPAG üzerinde ağrı sinyalleri ghrelin sayesinde daha yoğun olarak baskılanabilmektedir ve bu peptid GHS-R1α reseptörlerine bağlanarak analjezi sağlar Zeng ve ark. (2013). Peptides Ghrelinin anti-nosiseptif etki göstermesi aynı bölgede olan opioid reseptörlerle olan etkileşiminden kaynaklanmaktadır Tamaddonfard ve ark. (2017). Veterinary Research Forum AMP’den oluşan ikincil haberci cAMP adenilat siklaz enzimi sayesinde oluşur ve bu reaksiyon G proteinleriyle olan etkileşim sonucu gerçekleşmektedir Zeng ve ark. (2013). Peptides

TARTIŞMA Proinflamatuar sitokinleri de inhibe edebilme kabiliyetinde olan ghrelin morfin tarafından gerçekleştirilen adenilat siklaz inhibisyon reaksiyonuna katkıda bulunarak morfin analjezisini artırmaktadır. Antagonist GHRP-6’nın morfin analjezisi üzerine anlamlı bir etkide bulunmamaktadır

TARTIŞMA Oreksin-A potasyum kanallarını inhibe ederek analjezi gerçekleştirmektedir Qu ve ark. (2017). Journal of Neuroinflamation İntra-LC olarak uygulanan oreksin-A bu bölgedeki nöronları aktive eder Ghaemi-Jandami ve ark. (2017). Brain Research Adenilat siklaz enzim aktivitesi ile oluşan cAMP’nin indüklediği kimyasallar öreksin salgılayan nöronların alt kümelerine etki eder Georgescu ve ark. (2003). Journal of Neuroscience

TARTIŞMA Çalışmamızda oreksin-A ve antogonisti SB morfin analjezisi üzerine anlamlı bir etki göstermemiştir

TARTIŞMA LPGi’de bulunan reseptörlere bağlanan oreksinler ve diğer peptidler morfinin analjezik etkisini baskılayabilir Elalheh ve ark. (2011). Knowledge and Health Dopaminerjik nöronların morfine karşı bağımlılık oluşturması için OX1r reseptörlerinden gelecek olan sinyallere ihtiyaçları vardır. Bu nedenle morfin daha çok bağımlılık fonksiyonlarına katılır ve analjezi inhibe olur Baimel ve ark. (2015). Journal of Neuroscience Morfin oreksin salgılayan nöronları inhibe edebilir. Bu durum tolerans hususunda ipuçları sunmaktadır Li ve ark. (2008). Journal of Neuroscience

TARTIŞMA Elde ettiğimiz bulgulara göre oreksin-B’nin morfin analjezisini önemli bir şekilde azalttığı sonucuna ulaştık. TCS OX2 29 ise morfin analjezisi üzerine anlamlı bir etki göstermedi

TARTIŞMA Morfin tarafından aktive edilen mikroglialar ve VTA’da birçok oreksinerjik peptidin salgılanmasını sağlayan ghrelin arasındaki etkileşim morfine karşı gelişen toleransı azaltabilir Hassanzadeh ve ark. (2016). Acta Anaesthesiol Taiwan Ghrelinin G proteinleriyle etkileşimi daha yoğun bir şekilde adenilat siklaz enzim inhibisyonu sağlamaktadır Zeng ve ark. (2013). Peptides

TARTIŞMA Çalışmamızda ghrelinin sentetik formu hexarelin morfine karşı gelişen toleransı azaltıcı yönde etki gösterdi. Antagonist GHRP-6 morfin toleransı üzerine anlamlı bir etki göstermemiştir

TARTIŞMA SB VTA üzerinde OX1r reseptörlerine bağlanarak, endojen opioid peptidlerin ve nöropeptidlerin ödül ve bağımlılık sürecine daha yoğun bir şekilde dahil olmaları nedeniyle morfin, morfin tolerant ratlarda anlamlı bir analjezik etkinlik oluşmaktadır Erami ve ark. (2012). Biochemistry and Behavior

TARTIŞMA Deneylerde elde ettiğimiz bulgular oreksin-A antagonisti SB morfin toleransını azaltıcı yönde etki gösterdi. OX1r ve OX2r reseptörlerine agonist olarak bağlanan oreksin-A morfin toleransı üzerine anlamlı bir etki göstermemiştir

TARTIŞMA Oreksinerjik nöronlarda sinyal iletimi opiyatlar tarafından inhibe edilmektedir Li ve ark. (2008). Journal of Neuroscience Oreksinerjik nöronlardan üretilmeyen, eksojen olarak verilen oreksin-B NAc’de opiyatlara karşı gelişen tolerans; reseptörlere, konsantrasyonlarına ve veriliş yollarına bağlı olarak azaltır

SONUÇ Morfin Analjezisi Ghrelin reseptör agonisti hexarelin morfin analjezisini anlamlı bir şekilde artırmaktadır GHRP-6, Oreksin-A, TCS OX2 29, SB morfin kaynaklı analjeziye anlamlı bir etki etmemektedir Oreksin-B çok kısa bir süre sonra morfinin bu analjezik etkisini azaltmaktadır Morfin Toleransı Hexarelin, oreksin-B ve oreksin-A antagonisti SB anlamlı bir şekilde morfin toleransı azaltıcı yönde etki göstermiştir GHRP-6, Oreksin-A ve TCS OX2 29’un morfin toleransı üzerine anlamlı bir etkisi bulunmamaktadır

Teşekkürler…