Ankara ili marul ekim alanlarında saptanan virüs enfeksiyonları Filiz RANDA ZELYÜT1,2, FİLİZ ERTUNÇ2 1Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü 2Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü ÖZET Ankara ili marul ekim alanlarında Mayıs-Haziran 2015 tarihleri arasında yapılan arazi gibi değişik simptomlar gözlemlenmiştir. Viral belirti gösteren veya göstermeyen toplam 324 bitki örneği yaprakları ve kökleriyle toplanmıştır. 324 yaprak örneği; Mirafiori lettuce big vein virus (MiLçalışmalarında bitkilerde genel olarak bodurlaşma veya büyüme geriliği, yapraklarda kabarcıklaşma, gevrekleşme, mozaikleşme, klorotik ve nekrotik lezyonlar, yaprak damarlarının aşırı ve yoğun irileşmesi, küçük baş oluşumu BVV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Lettuce mosaic virus (LMV) etmenlerine karşı spesifik antiserumlar kullanılarak Double- antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) ile testlenmiştir. Lettuce big vein virus (LBVV) antiserumunun bulunmaması nedeniyle bütün örneklerden total RNA ekstraksiyonu yapılmış, bunlardan cDNA elde edilmiş ve PCR yöntemi ile testlenmişlerdir. CMV ve TSWV virüsleri Ankara ili marul ekim alanlarında tespit edilmemiştir. 39 örnekte MiLBVV, 25 örnekte LMV, 6 örnekte LBVV etmenleri tespit edilmiş olup 5 örnekte MiLBVV ile LBVV karışık enfeksiyon belirlenmiştir. GİRİŞ Genel olarak marul üretimi Akdeniz ve Ege bölgelerinde yoğunlaşmış olup Orta Anadolu’da Ankara ilinde üretim önem kazanmış olup ekonomik kalkınmada yerini almıştır. 2013 yılı TÜİK verilerine göre Ankara ilinde toplam 67315 ton marul üretilmektedir.5 Araştırma Sonuçları ve Tartışma ELISA testleri sonucunda 324 örnekte 25 LMV, 39 MiLBVV etmenleri saptanmıştır. CMV ve TSWV etmenleri ise hem moleküler olarak hem de serolojik olarak saptanmamıştır. RT- PCR çalışmaları ile sırasıyla 800 bp büyüklüğünde LMV, 496 bp MiLBVV, 296 bp LBVV spesik bantları elde dilmiştir (Şekil 1, 2 ve 3.) MATERYAL VE YÖNTEM Çalışma materyalini Ankara ilçeleri marul ekim alanlarından temin edilen marul bitkisi oluşturmuştur. Ekili arazilerin büyüklükleri göz önüne alınarak ve simptomolojik gözlemlere dayalı olarak; toplam yaprak ve kökten oluşan 324 marul örneği toplanmış, etiketlenmiş ve muhafaza edilmek –20°C'deki derin dondurucuya yerleştirilmiştir. Söz konusu virüslerin belirlenmesi için toplanan örnekler DAS-ELISA, RT-PCR’ a tabi tutulmuştur. DAS-ELISA DAS-ELISA testi Clark ve Adams (1977) tarafından bildirilen yönteme göre yapılmıştır. Total RNA İzolasyonu Total RNA izolasyonu için 3 farklı izolasyon metodu uygulanmıştır. RNA’ların kaliteli eldesi için Astruc vd. (1996) ve Foissac vd. (2001) tarafından önerilen protokoller, ticari RNA izolasyon kiti 8 tanesi enfekteli toplam 9 örnek üzerinde ön deneme yapılmıştır. Ticari kit ile daha saf, hızlı ve temiz RNA elde edildiği için izolasyon çalışmalarına kit ile devam edilmiştir. cDNA Eldesi ve RT-PCR Yöntemi Virüs genomu üzerindeki kılıf protein bölgelerin çoğaltılması amacıyla; Tablo 1.’de yer alan primer çiftleri kullanılmıştır. cDNA eldesi ve RT-PCR çalışması Alan (2012)’ nın çalışmasına göre modifiye edilmiştir ve 2 aşamalı olarak çalışılmıştır. Şekil 1. 800 bp uzunluğunda LMV’ ye ait coat protein bölgesi Şekil 2. 496 bp uzunluğunda MiLBVV’ ye ait coat protein bölgesi Primer Çiftleri Dizi Çoğaltılan cDNA Büyüklüğü ve Bölgesi   Referans CMV RW8-GGTTCGAAAGAGATATAACCGGG RV11-GTTTATTTACAAG AGCGTACGG 650 bp-RNA-2 Finetti-Sialer vd. (1999) LMV 1196-AAGGCAGTAAAACTGATG 1087-TTTATACTACAGTCTTTA 800bp-CP Krause-Sakate vd.(2001) LBVV VP 248-CGCCAGGATCTTTGATCCATCTG VP 249-TTGCGACATGTTCCTCCTCATCG 296bp-CP Navarro (2004) MiLBVV VP 286-TATCAGCTCACATACTCCCTATCG VP 287-CAACTAGCTCAGAATACATGCAG 469bp-CP Navarro vd.(2004) TSWV L1-TSWVF-ATCAGTCGAAATGGTCGGCA L2-TSWVR -AATTGCCTTGCAACCAATTC 276-RNA-Polimeraz Adkins vd. (2005) Şekil 3. 296 bp uzunluğunda LBVV’ ye ait coat protein bölgesi Örnekler de bodurlaşma, büyüme geriliği, klorotik ve nekrotik lezyonlar, damarlar etrafında klorozlar, damarların yoğun bir şekilde irileşmesi, küçük baş oluşumu ve yapraklarda kabarcıklaşma gibi simptomlar gözlemlenmiştir (Şekil 4. ve 5.). Ayrıca MiLBVV enfekteli göbekli marullarda baş bağlamama ve damarların yoğun irileşmesi söz konusu iken kıvırcık salatalarda damarlar etrafında klorozlar gözlemlenmiştir. Tablo 1. PCR’da kullanılan primerler Şekil 4. Yapraklarda mozaikleşme (Beypazarı) Şekil 5. Damarlarda irileşme (Beypazarı) Kaynaklar Alan, B. 2012. ‘’Doğu Akdeniz Bölgesi’nde Yetiştirilen Bazı Kışlık Sebzelerde Hastalık Yapan Virüslerin Tanılanması ve Karakterizasyonu’’, Çukurova Üniv. Fen Bil. Enst. Bitki Koruma Anabilim Dalı Doktora Tezi, Adana. Astruc, N., Marcos J. F., Macquarie G., Candresse G.T. and Vicent P. 1996. ‘’Studies on the Diagnosis of Hop stunt viroid in Fruit Trees: İdentification of New Host and Application of a Nucleic Acid Extraction Procedure Based on Non-Organik Solvents’’, European Journal of Plant Pathology, 102, 837-846. Clark, M. F. and Adams A. N. 1977. ‘’Charecteristics of the microplate of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses’’, Journal of General Virology, 34, 475-483. Foissac, X., Svanella-Dumas L., Dulucq M .J., Candresse T. and Gentit P. 2001. ‘’Polyvalent detection of fruit tree tricho, capillo and foveaviruses by nested RT-PCR using degenerated and inosine containing primers (PDO RT-PCR)’’, Acta Horticulturae, 550, 37-43.