Polimorfizm/Mutasyon tarama teknikleri Yrd. Doç. Dr. Bengi ÇINAR KUL

Not: Polimorfizm bireyin herhangi bir gen açısından en az 2 alleli olması durumudur (A yada a gibi) Bir popülasyonda aynı gen için çok farklı alleller olabilir (multipleallelizm)

Polimorfizmin yararları Pedigrinin saptanması,soy testi, babalığın belirlenmesi Polimorfik genlerden verim ve hastalıklara dayanıklık ile ilgili işaret gen olarak yararlanılması. Tek yumurta ikizliğinin belirlenmesi (özellikle sığırlarda önemli) Irkların kökenlerinin belirlenmesi, popülasyon genetiği ve hayvan ıslahı çalışmaları.

Polimorfizmin temelinde ne vardır? Nasıl bir mutasyon olmalıdır? Sessiz Nötral Missense Fonksiyon kaybı veya artışı

Bazı Mutasyon Tarama Teknikleri 1. Direkt Mutasyon Tarama Yöntemleri RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Kesim parçası uzunluk polimorfizmi ASA (Allele Specific Amplification) DNA Dizi Analizi SNP mikroarray 2. İndirekt Mutasyon Tarama Yöntemleri SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (High Resolution Melting – HRM)

PCR Polymerase Chain Reaction Polimeraz Zincir Reaksiyonu: DNA’nın belirli bir bölgesinin tüp içinde çoğaltılması işlemi… Bu teknik ile DNA molekülünde istenilen bir parçanın milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını yapmak mümkündür. Mutasyon tarama tekniklerinin birçoğu PCR temellidir.

Replikasyonun laboratuar ortamında taklit edilmesidir. Çift sarmal DNA açılır DNA polimeraz enzimi yeni ve komplementer iplikçiği üretir.

PCR’ın aşamaları 1- DENATÜRASYON 2- PRİMER BAĞLANMASI DÖNGÜ 3- UZAMA Sıcaklık ve zaman yönünden 3 farklı aşamanın arka arkaya tekrarlanmasına dayanmaktadır. 1- DENATÜRASYON 2- PRİMER BAĞLANMASI DÖNGÜ 3- UZAMA

1- DENATÜRASYON Çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklık altında (93-96⁰C) çözülerek tek zincir hale geçmesidir. Hidrojen bağlarının kırılmasıyla olmaktadır. 2- PRİMER BAĞLANMASI Hedef bölgeye komplementer primerin tek iplik DNA’da ilgili bölgeye bağlanmasıdır (54-64⁰C). 3- UZAMA DNA polimeraz enzimi, primerlerin ucuna kalıp DNA’ya eşlenik bazlar (dNTP) ekleyerek yeni DNA iplikçiğini uzatır. (70-72⁰C) Bir döngü sonunda her DNA iki katına çıkmış olur!!! Her döngüde 2n

PCR Reaksiyonu için gerekenler: Kalıp DNA Primerler Sıcaklığa dirençli polymerase DNA Polymerase dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) Tampon çözelti + Mg++ Thermocyler (ısı döngü cihazı) Thermus aquaticus

Animasyon (http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E)

PCR ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz Jel elektroforez

DNA ya da PCR ürünü agaroz jeldeki kuyucuklara yüklenir. DNA (–) yüklüdür ve (+) yüklü elektroda doğru hareket eder. DNA’nın büyüklüğünü ölçmek için DNA ladder (size marker) kullanılır. Agaroz jel elektroforezi görüntülenmesi genellikle Etidyum bromide ile yapılır. EB, DNA ile kompleks bir bağ kurarak UV ışık altında parıldamasını sağlar.

PCR- RFLP PCR’ın ardından restriksiyon enzimlerinin kullanılmasıyla mutasyon taranmasıdır. Restriksiyon enzimleri, DNA’da özgün dizileri tanır ve o noktadaki fosfodiester bağını keserler. Örneğin EcoRI enzimi GAATTC dizisini tanır ve G ile A bazları arasından fosfodiester bağlarını kırar. Restriksiyon enzimleri bakterilerin kendilerini koruma silahlarıdır.

PCR işlemi ardından EcoRI enzimi ile kesildiğinde; daha küçük iki band oluşuyorsa homozigot normal, PCR ürünü kesilmeden kalıyorsa homozigot mutant, 3 band görülüyorsa (normal ve mutanttan kaynaklanan) heterozigot bir bireydir denilebilir.

DNA dizi analizi DNA’nın nukleotid dizisinin saptanmasıdır. Eski olmakla beraber en sık kullanılan yöntem Sanger sekanslamadır. Bu teknik, normal dNTP´lerin (3 '-hidroksilli (OH-) yanı sıra 3'-hidroksil (OH-) grubu olmayan dideoksiribonükleozit trifosfatların (ddNTP) ve DNA Polimeraz enziminin yardımıyla DNA moleküllerinin 5’3’ yönünde uzatılmasına dayanır.

DNA’nın yapısı… Bir nükleotidin  5' ucunda bulunan fosfat grubuna başka bir nükleotidin 3' hidroksil grubu bağlanırsa  fosfodiester bağı oluşur. DNA’nın sentez yönü bu yüzden 5’ 3'

Reaksiyon sırasında DNA polimeraz tarafından sentezlenen PCR ürününe herhangi bir ddNTP´nin katılması ile 3´ pozisyonunda serbest hidroksil grubu olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam etmez. Bunun sonucu olarak da serbest Hidroksil grubu olmayan A,G,T ve C bazlarına bağlı olarak değişen boylarda PCR ürünleri oluşmaktadır DNA dizileme yöntemi

Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca kullanım alanları Kalıtsal hastalıkların genlerinin araştırılması, populasyondaki bireylerin taranması Verimle ilgili genlerin populasyonda taranması Moleküler ıslah Prenatal tanı Irkların ve türlerin tarihsel gelişiminin aydınlatılması Evrim çalışmaları ve antik DNA çalışmaları Adli çalışmalar (tür belirleme, ebeveyn belirleme) Hastalık etkenlerinin (viral, bakteriyal vs.) tür tayini Aşı üretimi Gıda katkılarının belirlenmesi GDO üretimi ve gıdalarda GDO varlığının belirlenmesi………..