Hazırlayan: Meltem ÖZCAN Konu : Klonlama

KLONLAMA DNA rekombinasyonu Transformasyon Selektif çoğaltım (Selective amplification) DNA klonlarının izolasyonu (Isolation of Desired DNA Clones) aşamalarıyla klonlama gerçekleşir.

Klonlama DNA fragmentlerini kopyalamak için kullanılan bir tekniktir. Klonlamada 2 farklı teknik kullanılabilir; 1-Hücreye dayalı teknik 2-PCR(Polymerase chain reaction)

Hücreye dayalı teknikteki yaklaşıma göre; konukçu hücreyle ilgili DNA fragmentini taşımak için bir vektör kullanılır. Şekil vektör olarak kullanılan plazmitlerin tipik prosedürünü göstermektedir.

a)DNA Rekombinasyonu: DNA fragmenti bir vektör içinde koyularak klonlanır.Rekombinant vektör antibiyotiye dayanıklı gen içermek zorundadır. b)Transformasyon: Rekombinant DNA konukçu hücre içine girerek hızla çoğalır.Transformasyon olarak adlandırılmasının sebebi konukçu hücreyi değiştirebilme fonksiyonunun olmasıdır. E.coli hücrelerini plasmid DNA ile ortamdan izole etmek zordur.CaCl2 ilavesiyle bu izolasyon sağlanabilir. c)Selektif Çoğaltım: Bu aşamada herhangi bir koruması olmayan ölü E.coli hücresine spesifik bir antibiyotik eklendi. Transforme olmuş E.coli antibiyotiğe dayanıklı gen tarafından korundu.Bu gen spesifik antibiyotiği inaktif hale getirdi.Önceki sayfadaki şekilde bulunan E.coli hücrelerinin çoğu birbirinden farklıdır.Çünkü her biri birbirinden bağımsız olarak çoğalmıştır. d)DNA Klonlarının İzolasyonu

Klonlama Vektörleri (Cloning Vectors) Vektör; DNA fragmentini konukçu hücreye taşıma aracı olarak kullanılır. Eğer vektör DNA fragmentini kopyalamak için kullanılırsa “cloning vector” olarak adlandırılır. Eğer DNA fragmentinde gen ifadesi için kullanılırsa “expression vector” olarak adlandırılır. Yaygın olarak kullanılan vektörler; plazmid, lambda phage, cosmid, yeast artificial chromosome (YAC)

Cloning Vectors Plasmid: Dairesel yapıdadırlar. Konukçu hücreden bağımsız olarak kopyalama işlemini gerçekleştirebilirler.Plazmid dizisinin büyüklüğü 1kb-100kb arasında değişiklik gösterir.

Cloning Vectors Şekildeki plazmid vektör; birçok farklı restriksiyon enzimini tanıyabilen bir polylinker (çoklu tanıyıcı), selektif çoğaltım için ampicillin-dayanıklı gen(amp) ve konukçu hücrede üreme için replikasyon orjinini(ORI) içerir.

Cloning Vector Gereksiz parçaları çıkararak ve gerekli diziler (sequence) ekleyerek doğal plazmidlerden plazmid vektör yapılır. Bir DNA örneğini klonlamak için vektörde ve DNA örneğinde aynı restriksiyon enzimi kullanılmalıdır. Sonuç olarak; bir vektör genellikle birçok restriksiyon enzimini tanıyan bir zincir (polylinker) içerir.Böylece vektör, DNA’nın çeşitli örneklerini klonlamada kullanılabilir.

Cloning Vector Lambda Phage: Bakterilere bulaşabilen virüslerdir.En büyük avantajı yüksek transformasyon etkinliği sağlamasıdır.Plasmid vektörden 1000 kat daha etkilidir.

Cloning Vector Şekil DNA klonlamada vektör olarak alpha phage kullanımını göstermektedir. Şekilde alpha phage virüsü DNA içine koyularak gereksiz bölgenin yerine geçer ve DNA klonlanır.Daha sonra in vitro assembly system ile alpha virion(nükleik asit ve kapsitten oluşan virüs) taşınarak Rekombinant DNA oluşturulur. Alpha genom 49 kb uzunluğundadır ve 25 kb yabancı DNA taşıyabilir.

Cloning Vector Figure; The assembly process of the alpha virion Alpha DNA; COS bögeleri olarak bilinir. 12 nükleotid uzunluğunda ve her biri tek iplikçiklidir. Dizilimleri birbirlerinin komplementi olduğu için; bir alpha DNA farklı bir alpha DNA ile baz çifti olabilir. İki alpha DNA böylelikle birbirine bağlanır ve dairesel bir DNA oluşur. Konukçu hücrede, ligaz COS bölgelerini bağlayabildiği için alpha DNA dairesel yapıdadır.

Cloning Vector Şekildeki proseste, Nu1 ve A proteinleri COS bölgesini tanır, alpha DNA ile proteinler boş bir kafa içinde biraraya gelir. Kafa dolduğunda kuyruk eklenir ve alpha virion oluşumu tamamlanır. Proteinler alpha genom’da genler tarafından kodlanır.

Cloning Vektor Cosmid:Cosmid vektör plasmid vektörün kombinasyonudur.alpha kafaya sokulan hedef DNA’ya COS bölgesi izin verir. Cosmid’in avantajları; Yüksek transformasyon etkisi sağlar. Plasmid ve alpha phage vektörlerinin sınırı 25 kb iken cosmid vektör 45 kb yabancı DNA taşıyabilir.

Cloning by Using Cosmid Vector

Cloning by Using Cosmid Vector Plazmid vektöre benzer şekilde cosmid vektörde amp, ORI ve polylinker bulunur.Ayrıca bir COS bölgesi içerir. Cosmid vektörler restriksiyon enzimiyle bölündükten sonra DNA fragmentleriyle bağlanır.Sonraki “assembly ve transformation” aşamaları alpha phage ile klonlamayla aynıdır.

Cloning by The Yeast Artificial Chromosome Vector YAC: Maya yapay kromozom vektörü (The yeast artificial chromosome) büyük DNA parçalarını tşıma kabiliyetindedir.(2 Mb üzerinde)Fakat transformasyon etkisi çok düşüktür.

YAC YAC vektörünün parçaları; Sentromerler(CEN), telomerler(TEL), konukçu hücrede çoğalma için automonous replicating sequence(ARS) Selektif çoğaltım için amp ve YAC vektörü içeren hücrelerin belirlenmesi için TRP1 ve URA3 gibi markerlar. Restriksiyon enziminin tanıdığı bölgeler ( EcoRI ve BamHI gibi)

Cloning by YAC Prosedür; 1- Hedef DNA EcoRI tarafından kısmen sindirilir ve YAC vektör EcoRI ve BamHI tarafından bölünür. 2- Bir yapay kromozomdan sindirilen DNA parçalarıyla bölünen vektör segmentleri bağlanır. 3- Transforme maya hücreleri çok sayıda kopya yapar.