PROTEOMİĞİN FARKLI YÜZLERİ Proteomik Analiz (veya Analitik Protein Kimyası) Proteinlerin, geniş ölçekte belirlenip güçlü analitik tekniklerle tanımlanması. Elektroforez/Kromatografi  MS ve/veya Edman degredasyonu  Posttranslasyonal modifikasyonların tanımlanması

Karşılaştırmalı Proteomik (“Differential Display”, yani Ayrımsal Gösterim Proteomiği). Analitik tekniklerle tanımlanmış proteinlerin karşılaştırılması PROTEOMİĞİN FARKLI YÜZLERİ

Hücrede Eşleme (Haritalama, Cell mapping) Proteomiği. Protein-protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmelerin belirlenmesidir. Bu tip analizler protein komplekslerinin tanımlanmasıyla veya doğrudan DNA okumasıyla (örneğin, maya iki-hibrit, faj gösterim, ribozom gösterim ve RNA-peptid füzyonları vb) gerçekleştirilir. PROTEOMİĞİN FARKLI YÜZLERİ

GEN ile PROTEİN arasında köprü kurmak amacıyla yürütülen proteomik stratejilerinin hemen hepsinde beş anahtar teknoloji platformu söz konusudur: ÖRNEK HAZIRLAMA PROTEİN AYRIŞTIRMA (elektroforez-kromatografi) PROTEİN TANIMLAMA (Edman yöntemi, MS, Western immüblotlama) PROTEİN KANTİTASYONU (Scanner, Phosphorimager) HÜCREDEKİ HEDEFİ BELİRLEME (maya iki hibrit, affinite yakalama)

ÖRNEK HAZIRLAMA (izolasyon ve preparasyon) PROTEİN BİLGİSİ OLUŞTURMA (peptid kütle/dizi bilgisi) YAPISAL PROTEOMİK PROTEİN TANIMLAMA (informatik veri değerlendirme) PROTEİN KANTİTASYONU (Protein miktarındaki değişimler) HÜCREDEKİ HEDEFİ BELİRLEME (protein-protein etkileşimleri, posttranslasyonel modifikasyonlar, hücresel lokalizasyon vb.bilgiler İŞLEVSEL PROTEOMİK METABOLOMİK

EN KRİTİK AŞAMA YETERİNCEve AMACA UYGUN ÖZELLİKTE PROTEİN ELDE ETME

Sorunlar ve Çözümleri ÖRNEK HAZIRLAMA

Doğal örneklerdeki proteinlerin konsantrasyon aralığı çok geniştir. Albumin 30 g/l ; somatotropin 0,3-0,5 µg/l Proteinlerin in vitro amplifikasyonu söz konusu değildir. Her tekrarda AYNI örnekleme yi yapmak her zaman kolay değildir. T üm proteinleri görüntüleyecek bir sistem yoktur. Proteazlar proteinleri parçaladıklarından, analiz esnasında çeşitlilik ve karmaşıklık artar.

Örnek Toplama En güncel yöntemlerde bile problemler ve kısıtlamalar vardır. Bununla birlikte, pek çok proteomik çalışmasında başarısızlık, 1. kademe olan örnek toplamadan ileri gelir. ARAŞTIRMA DİZAYNI Çalışma grupları: Hastalıklı- sağlıklı ; İlaç uygulaması yapılmış-yapılmamış birey ; X proteinini taşıyan-taşımayan bireyler vb… Problem : Klinik araştırmalar ve diğer araştırma çalışmaları: Bireyler arasındaki farklar ve heterojen örnekleme Diğer Araştırma Dizaynları: KLİNİK ARAŞTIRMALAR DENEYSEL ARAŞTIRMALAR: Örnekleme daha sorunsuz; tekdüze genetik yapı, kontrollü koşullar

Örnekteki protein miktarı  Uygun tür, organ veya gelişim evresi  Yeterli miktarda (ağırlık, sayı, hacim) biyolojik materyal  Doğru izolasyon tekniği  Ön ayırma ve fraksiyonlama işlemleri (ör. diferansiyel santrifüjleme, elektroforez)  Konsantrasyon stratejileri (ör. çöktürme)  Klasik saflaştırma stratejileri

Örnek Toplama Deney grupları: Hastalıklı-Sağlıklı; İlaç uygulaması yapılmış-yapılmamış; X proteinini taşıyan-taşımayan….vb. Hücre kültürü, deney hayvanı vb. kontrollü sistemlerde örnek toplama daha sorunsuz. Kararlı genetik yapı, aynı koşullar, aynı beslenme durumları… PEKİ KLİNİK ÇALIŞMALAR???

Karaciğer hücreleri ile karaciğer tümörlerinin proteomlarını 2D ile karşılaştırdığınızda; farklı spotlar gözlenir. Bu spotların hangileri tümörden kaynaklanır ?? Çoğu tümörler büyük, tek düze hücre kümeleri oluşturmazlar, sağlıklı dokulara çok sayıdaki küçük hücre kümeleri halinde sızarlar. Örneğin nasıl nereden alındığı önemlidir, heterojen dağılım olabilir. Bazen az, bazen çok sayıda kanser hücresi elde edersiniz, bazen az, bazen çok sayıda endotel hücresi elde edersiniz. Hepatositlerin proteomları yaşa ve duruma göre de farklılık gösterir. SORUNLU ÖRNEKLER

Örnek alma problemi. Dokunun heterojen kompozisyonundan dolayı, protein spektrumu kalitatif ve kantitatif olarak örneğin nereden ve nasıl alındığına bağlıdır.

Bu heterojen doku sorununun üstesinden gelmek için: Örneğin, Lazer mikrodiseksiyon tekniği geliştirilmiştir (Banks ve diğ., 1999).

Örnek yüklenir Çözünme Küçük tüp, ependorfa alınır Yapışma Doku örnekleri mikrotomlarla küçük parçalara bölünür. Parçalar hematoksilin ve eosinle boyanır. Boyanmı ş parçalar cam plaka üzerine yayılır ve inverted mikroskop ile incelenir. Böylece tümörler belirlenebilir, deney tüpü tümör bölgesine de ğ dirilir. Küçük tüpün uç kısmı UVA polimer filmiyle kaplıdır ve bu film dokuya de ğ er. Dokuların kanserli kısımları filme yapı ş ır ve bu istenilen alana yönlendirilmi ş lazer ı ş ını uygulanır. Yapı ş ma tamamlandı ğ ında, ona ba ğ lı dokuyu ta ş ıyan filmle birlikte tüp çıkartılır Parçanın geri kalan kısmı cam plaka üzerinde kalır. Tüp, kaba yerle ş tirilir. Kapta örnek tamponu vardır ve tersyüz edilerek çözünme sa ğ lanır.

Saf meme epitel hücrelerinin Lazer mikrodiseksiyon tekniği ile transferi. transfer filmine alınan epitel hücreleri seçilen ve uzakla ş tırılmı ş hücrelerin doku kesitindeki görünümü

UYGUN TAMPON ???? 2D’de ilk kademe IEF olduğundan, proteinler yüklerini taşımalı, Örnek tamponu, proteinleri olabildiğince iyi çözmeli ve alt birimlerine ayırabilmeli, Agregasyonu engellemeli, Tüm proteazları denatüre etmelidir. Hangi örnek tamponu bunu yapabilir ? Hiçbirisi ! Tüm tamponlar  üre (3-8 M), deterjan (NP-40 ya da CHAPS) ve redükleyici ajan (merkaptaetanol veya DTT) içerir: Örneğin, 8 M üre, %4 (w/v) CHAPS, 40 mM Tris ve 65 mM DTT ve bromofenol mavisi

Dializ, kromatografi ve benzeri manipülasyonlardan OLABİLDİĞİNCE KAÇINILMALI….. Çok sayıda manipülasyon İLAVE İŞLEMLER Çok fazla protein kaybı ANCAK BAZEN KAÇINILMAZDIR

Bazı çalışmalarda ÇOK SAF proteine gereksinim vardır: Amino asit dizisini belirlenmesi X-ışını difraksiyonu ile yapı tayini Terapötik protein eldesi

Hemen her zaman FRAKSİYONLANMIŞ proteine gereksinim vardır: Rezolüsyonu artırır. Analizi kolaylaştırır. Daha doğru sonuca ulaştırır.

ÇÜNKÜ: BOL BULUNAN PROTEİNLER AZ BULUNANLARI SAPTAMIMIZI ENGELLER En başarılı 2D jellerde bile ancak 1500 proteinin ayrıştırılması söz konusu olduğundan, bu teknik, eğer ham protein karışımı (örneğin, hücre lizatı) ile çalışılıyorsa bol bulunan proteinlerle sınırlıdır. UYGULANACAK ÖRNEK MİKTARI SINIRLIDIR. 2D elektroforezinDE, ilk boyutta immobilize pH gradient jeline uygulanabilecek madde miktarı oldukça azı (~ 150 µg – birkaç mg), dolayısıyla incelenen örnekte ölçeklendirme olanağı sınırlıdır.

A)B) Şekil 2. A) Ön saflaştırma ve fraksiyonlama yapılmadan önceki, B) ve sonraki jel görüntüleri AB BOL BULUNAN PROTEİNLERİN ENGELLEMESİ

Şekil 3. Coomassie ile boyanmış 2D-PAGE jellerinde albumin /IgG uzaklaştıması yapılmamış (solda) ve yapılmış (sağda) plazma örnekleri

ZENGİNLEŞTİRME YÖNTEMLERİ Kromatografik Yöntemler Normal basınç ve yüksek basınçta (HPLC) uygulanan kolon kromatografileri (jel filtrasyonu, iyon değişimi, afinite kromatografisi vb) Elektroforetik Yöntemler Preparatif elektroforez Elektroforez öncesinde sıvı fazda fraksiyonlama Sıvı fazda izoelektrik odaklama

ÖZEL ZENGİNLEŞTİRME YÖNTEMLERİNE ÖRNEKLER MicroRotofor™ Liquid-Phase IEF Cell

Qproteome albumin/IgG depletion kitinin kullanımı