İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ

... konulu sunumlar: "İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ"— Sunum transkripti:

1 İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ
GAZ KROMATOGRAFİSİ

2 Gaz Kromatografisi Gaz kromatografisi tekniği ilk defa olarak James ve Martin tarafından 1952 yılında uçucu yağ asitleri karışımlarının analizlerinde ve ayrılmasında kullanılmıştır. Hemen hemen tüm kimya, biyokimya , biyoloji ve mühendislik alanlarında uygulamaları günümüzde görülmektedir. Bir değerlendirmeye göre (istatiksel bir araştırmada) gaz kromatografisi sistemi dünyada ’den fazla yerde kullanılmaktadır. Son yıllarda kromatografi, yaygın bir şekilde analitik bir metot olarak kabul edilmiştir.

3 Gaz Kromatografisi Gaz kromatografisi, fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklardan yararlanarak, bir karışımı oluşturan bileşiklerin birbirinden ayrılmasıdır. Gaz kromatografisi, analitik kimya alanında gazların ve uçucu maddelerin analizleri ve ayrılmasında uygun bir metot olarak yaygın bir şekilde kabul edilmiştir. Ölçmenin kısa sürede ve çok duyarlı şekilde başarılması da metodun üstünlüğünü ortaya koymaktadır.

4 Avantajı Gaz kromatografisi yöntemi, çok etkili bir ayırma olanağı sağlaması, ayrılan bileşenlerin tanımında duyarlılık sağlaması, ayrılmanın hızlı oluşu, aynı zamanda hemen hemen her grup ilaç maddesine uygulanabilmesi bakımından da üstün bir farmasötik ilaç analiz yöntemidir.

5 Gaz kromatografisinde iki faz mevcuttur;
Yarıçapı küçük, çok uzun bir boru içine yerleştirilmiş geniş yüzeyli (gözenekli) bir maddeden meydana getirilen sabit faz (kolon). Bu sabit faz içindeki geniş yüzeyli (gözenekli) madde arasından kolaylıkla geçebilen hareketli faz (bu faz inert, saf ve uçucu bir gazdır ve genellikle azot ya da helyumdur).

6 Gaz Kromatografisinin Türleri
Sabit fazın yapısına göre gaz kromatografisi ikiye ayrılır, Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (en çok kullanılan gaz kromatografisi türüdür.)

7 Gaz-katı kromatografisi; adsorpsiyon olayına dayandığından elde edilen pikler kuyruklu olduğu için ayrılmaları güçleştirirler. Bu nedenle gaz-katı kromatografisi az kullanılır. Sadece H2, O2, N2, NO, CH4, C2H4, C3H6 ve C3H8 vb. gazların analizlerinde kullanılmaktadır. Gaz-sıvı kromatografisi; yüzeyi geniş gözenekli katı maddeye (sabit faza) özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı maddenin gözenekleri dahil bütün yüzeyine dağılır ve sabit bir faz gibi davranır. Hareketli olan gaz fazı, bu fazın içinden kolayca geçer. Analizi yapılacak numune içindeki maddeler bu iki faz arasında özelliklerine göre dağılırlar. Ayırmanın yapıldığı sıcaklıkta, ölçülebilen bir buhar basıncına sahip olan hemen hemen tüm organik yapıların ayrılmasında kullanılabilir.

8 Gaz Kromatografi Cihazı
Kromatografik sistem şematik olarak şekilde görülmektedir:         

9 Gaz Kromatografisi Cihazının Ana Kısımları
Sürükleyici gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım, Numune enjekte etme kısmı, Kolon kısmı, Isıtma kısmı, Dedektör kısmı, Kaydetme kısmı.

10 Shimadzu marka bir GC cihazının genel görünümü.

11 Taşıyıcı Gaz Görevi; buharlaşmış maddeleri kolona taşımaktır. Gaz, içinde basınçlı taşıyıcı gaz bulunan silindirden regülatör yardımı ile basıncı düşürülerek, sabit akış hızında kolon sistemine gönderilir. Öteki kromatografi dallarında olanın aksine, GC kromatografisinde ayrılmaları istenen maddelerle hareketli faz arasında hiçbir etkileşme olmaz. Hareketli fazın görevi sadece maddeleri taşımaktır. Uygun bir taşıyıcı gaz; Ayrılacak bileşik ve sabit fazla reaksiyona girmemeli, Gaz difüzyonunu en düşük düzeyde tutabilmeli, Saf, kolay bulunabilir ve ucuz olmalı, Kullanılan dedektörlere uygun olmalıdır.

12 Gaz Kromatografisi Kolonları
Sistemin en önemli kısmıdır. Ayırma işlemi burada gerçekleşir. Ayırma işleminin başarılı olması, büyük ölçüde uygun kolon seçimine bağlıdır. Kolonlar, bakırdan, alüminyumdan, paslanmaz çelikten, camdan veya teflondan olabilir. Cam kolon, en çok tercih edilen kolondur ama kullanımı zordur. En çok kullanılan paslanmaz çelikten olan kolonlardır. Kolonların şekli, u-şeklinde veya spiral şeklinde olabilir.

13 Kolon Tipleri Kapiler Dolgulu Dolgulu Uzunluk (metre) İç Çap (mm)
0.5-10 5-100 İç Çap (mm) 2-4

14 Dolgulu Kolonlar; daha büyük miktarlardaki ayrımları gerçekleştirebilirler. Daha çok preparatif çalışmalarda kullanılırlar. Kapiler Kolonlar; genellikle silika ve türevlerinden yapılırlar. İç çapları 0,25-0,53 mm , ortalama uzunlukları metredir. Kaplama film kalınlıkları ise 1 mikrondur. Etkinlikleri (plato sayıları) dolgulu kolonlara göre daha fazladır.

15 Örneğin Kolona Verilmesi
Ayrılacak bileşikler, kolon girişine bir seferde verilir. Gazlar, gaz kaçırmayan şırınga veya özel gaz muslukları kullanılarak, sıvılar şırınga kullanılarak, katılar ise önce inert ve uçucu bir çözücüde çözülüp sonra şırınga kullanılarak sisteme verilir. Madde, enjekte edildiği yerde, enjektör ısıtıcısının verdiği ısı ile hemen buhar haline geçer ve taşıyıcı gaz ile sürüklenir. Bir karışım içindeki maddeler, kolonun verimlilik derecesine bağlı olarak kolonu farklı zamanlarda terk ederler. Maddeler kolonda iken, kolonun fırın sıcaklığı, bu maddelerin buhar halinde bulunabileceği bir derecede sabit tutulur. Kolondan farklı zamanlarda çıkan buhar halindeki maddeler, taşıyıcı gaz ile dedektöre taşınır. Dedektör taşıyıcı gaz içindeki maddeyi alır ve bunu bir sinyale çevirir. Sinyal maddenin konsantrasyonu ile orantılıdır. Bu sinyaller sıra ile bir kaydediciye gönderilir. Yazıcıda her maddenin enjekte edildiği andan kolonu terk ettiği ana kadar geçen zaman süreci içindeki konsantrasyonu saptamaya yarayan piklerden ibaret bir grafik verir. Bu grafiğe diferansiyel gaz kromatogramı denir.

16 Gaz Kromatogramı

17

18

19 Genel olarak, kullanılan kolonun çapına göre verilebilecek sıvı miktarları aşağıdaki gibidir.
Kolon Hacmi (inch) Sıvı Miktarı (ml) 1 0.02-2 1/4 0.2-20 1/8 0.04-4 1/16 (kapiler kolon)

20 Sabit Faz Uygun fazı seçmek için kullanılan kesin bir yöntem yoktur, ancak uygun bir sabit faz sıvısı aşağıdaki özellikleri taşımalıdır: Ayrılacak bileşikler için iyi bir çözücü olmalıdır. Kimyaca inert olmalıdır. Ayrılacak bileşiklerin hepsini çözmüyorsa, bir kısmını iyi çözmelidir ki çözünmeyenler önce, çözünenler sonra kolonu terk ederek ayrılma gerçekleşsin. Uçucu olmalıdır (kaynama noktası yüksek olmalı). Termal kararlılığı olmalı, sıcaklığa dayanıklı olmalı, kolon sıcaklığında parçalanmamalıdır. Ayrılacak bileşenlerle reaksiyona girmemelidir.

21 Dedektörler Bir GC dedektör, kolondan gelen taşıyıcı gaz içinde bulunan binde kısım oranındaki yabancı bir gazı tespit edebilen bir araçtır. Bir gazın pikinin dedektörden geçme zamanı, en fazla bir saniye kadardır.

22 Bir dedektörde aranan başlıca özellikler şunlardır :
Duyarlılığı yüksek olmalıdır. Duyarlılığı geniş bir konsantrasyon aralığında olmalıdır. Her çeşit bileşiğe duyarlı olmalıdır. Gaz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden etkilenmemelidir. Sağlam olmalıdır.

23 Bütün bu koşulları sağlayan ideal bir dedektör yoktur,
ancak verileri bu şartlara yaklaşanlar vardır. Bunlar: Isı İletken Dedektörler (TCD) Alev İyonlaştırma Dedektörleri (FID) Elektron Yakalama Dedektörleri (Çok az miktarda dedekte edilebilir.)

24 Isı İletken Dedektörler (TCD)
En çok kullanılan dedektörlerdendir. Çeşitli gazların ısıyı değişik oranlarda iletmesi esasına dayanır. Konsantrasyon değişimine duyarlıdır. Böyle bir dedektörde, sabit bir akımla ısıtılmış volfram bir telden yararlanılır. Taşıyıcı ve dedektör gazları aynı olmalıdır. Genellikle Helyum kullanılmakla birlikte, Hidrojen, Argon, Azot ve Metan gibi gazlar da kullanılır.

25 Alev İyonlaştırma Dedektörü (FID)
Yüksek hassasiyeti ve kararlılığından dolayı en çok kullanılan dedektördür. Kütle akış hızına duyarlıdır. Kolondan çıkan organik maddeler, hidrojen alevinde yakılarak iyonlaştırılır ve meydana gelen pozitif iyonlar dedektörde akım değişimine neden olur. Oluşan akım, birim zamanda alevden geçen karbon miktarı ile doğru orantılıdır. C-H bağı içeren tüm bileşiklere duyarlı iken, sadece kükürt bileşikleri, su, amonyak ve azot oksitlerine karşı duyarsızdır.

26 FID dedektör

27 Elektron Yakalama Dedektörü (ECD)
Sinyal artışı yerine sinyal kaybını ölçer. Taşıyıcı gaz (genellikle azot) radyoaktif bir ortamdan geçerken iyonize olur. Hassasiyeti halojenli bileşikler ve azotlu bileşiklere karşı yüksek, alkollere ve hidrokarbonlara karşı düşüktür. Dezavantajları; linearitenin dar olması, kullanım için izin gerekli olması ve taşıyıcı gazın ultra saf olması gerekliliğidir.

28 Kaydetme (Recorder/ Integrator)
Detektörde algılanan akımın elektriksel sinyale çevrildikten sonra, hesaplamaların rahatlıkla yapılabilmesi için bir ölçekli şeritli kağıda kaydedildiği cihazlardır. Pik çıkışları kaydediciden (recorder) alınır ve alan boyları bulunduktan sonra faktörle çarpılarak hesaplama yapılır. İntegratör ise hem kaydedici, hem de alan ve boylar ile faktörlere göre hesabı kendi yapan daha komplike bir kaydedicidir.

29 Sıcaklık Kontrolü Ayrılmanın kesin olarak aynı şekilde tekrarlanabilmesi için üç kısmın sıcaklığının ayrı ayrı kontrol edilmesi gereklidir. Bunlar; Enjeksiyon kısmının sıcaklığı, Kolon sıcaklığı, Dedektör sıcaklığı.

30 Gaz Kromatografisinden Elde Edilen Yararlar
Verilen bir numune içindeki uçucu maddelerin sayısının tayininde; verilen numuneden elde edilen her pik ayrı bir maddeyi gösterir. Bu kromatografinin en önemli yönlerinden birisidir. Bir maddenin saf olup olmadığının araştırılmasında; saflığı kontrol edilen madde birden fazla pik vermişse, safsızlık var demektir. Piklerin altında kalan alanların birbirilerine oranı, madde ve yabancı maddenin karışıma oranı kadardır. Yeni geliştirilen bir metodun ne derecede duyarlı olduğunun araştırılmasında kullanılır.

31 GC’nin Kullanım Alanları:
Günümüzde; Biyokimya, biyoteknoloji, petrokimya, farmakoloji (eczacılık-ilaç analizleri) alanlarında, Bitkisel yağlardan sterollerin ayrılmasında, Genetik, gıda sektörlerinde, Adli tıp toksikoloji laboratuarlarında, Amino asitlerin kalitatif ve kantitatif tayinlerinde, Temiz su, Atık su, Katı Atık ve Atık yağ numunelerinde bulunan düşük miktarlardaki mineral yağ ve hidrokarbonların belirlenmesi amacıyla ayırma ve analiz için kullanılmaktadır.

32 GC’nin Endüstride Çok Kullanılmasının Nedenleri:
İzomerler dahil çok karmaşık örneklerin bileşenlerine ayrılabilmesi, Hızlı bir şekilde sonuç alınabilmesi, Çok az düzeyde (mikrolitre) örnek gerektirmesi, Sistemin çok düşük buhar basıncı gösteren (kaynama noktası) örneklerde bile kullanılabilmesi, Diğer aletli analiz yöntemlerine oranla daha güvenilir ve basit aletlerle analizlerin yapılabilmesi, Nitel ve nicel olarak daha duyarlı sonuçların elde edilmesi ve genellikle bu sonuçların yorumlarının kullanılması, Sanayi için anında analiz yapılabilecek Gaz Kromatografisi cihazlarının geliştirilmiş olmasıdır.

33 Gaz Kromatografisi ile Kalitatif ve Kantitatif İlaç Analizleri:
Kalitatif analizde en çok kullanılan yöntem, bilinmeyen madde ile standardının aynı kolondan, aynı koşullar altında alınmış alıkonma zamanlarını karşılaştırmaktır. Analiz örneği ile standardın ayrı ayrı kromatogramlarının alınmasının yerine, her ikisinin karışımının kromatogramı alınır. Eğer bilinmeyen madde standartla aynı ise bir tane pik elde edilecek, aksi halde iki ayrı pik elde edilecektir. Kantitatif analizde, pik alanı ile dedektörden geçen madde miktarı arasındaki ilişki, pik alanlarından yararlanılarak miktar tayini yapma olanağını sağlar. Bu amaçla bir seri standart çözelti hazırlanır ve bu standart çözeltilerin konsantrasyonuna karşı, pik alanlarının değeri kullanılarak bir grafik çizilir. Bu grafikten, miktarı tayin edilecek maddenin kromatogramdaki pik alanı değerine karşı gelen madde miktarı bulunur.