Hastalık ve yatkınlıklarını moleküler düzeyde inceleyen alana moleküler tıp yada moleküler tanı adı verilir.

... konulu sunumlar: "Hastalık ve yatkınlıklarını moleküler düzeyde inceleyen alana moleküler tıp yada moleküler tanı adı verilir."— Sunum transkripti:

1 Hastalık ve yatkınlıklarını moleküler düzeyde inceleyen alana moleküler tıp yada moleküler tanı adı verilir.

2 İnsan genom projesinin tamamlanmasıyla birlikte son 5 yılda teknolojik ilerlemeler ve belirli alanlarda özelleşmeleri de beraberinde getirmiştir. Şu anda tıpta en hızlı gelişen alan olmuştur. Bu derste şu anda geliştirilmiş olan ve kullanılan bazı testler ve yaklaşımlar anlatılmaktadır. Moleküler teknikler kansere neden olan germ hücre mutasyonlarını test etmek içinde kullanıldığı gibi (BRCA1 cystic fibrosis gibi) viruslar (Epstein Barr) ve viral yükleri (Kırım-Kongo) belirlemek içinde kullanılmaktadır.

3 Bazı genetik hastalıklarda tek bir protein ya yoktur yada bozuktur.
Figure One Gene, One EnzymeIn some human genetic diseases, a single protein is missing or nonfunctional. Review Figure 17.1 Bazı genetik hastalıklarda tek bir protein ya yoktur yada bozuktur.

4 Gen haritalama genin kromozom üzerindeki spesifik yerinin belirlenmesidir. Genetik bir hastalığın nedeninin anlaşılmasındaki en kritik evredir. İki tip haritalama vardır Genetic Mapping – bir kromozom üzerinde 2 gen arasındaki kısmi pozisyonu linkaj analizi kulanarak belirlemektir. Physical Mapping – bir kromozom üzerinde bir genin tam pozisyonunu belirlemek için tüm tekniklerin kullanılması. Gen haritalamanın en önemli rolü hastalık genlerinin yerini bulmak ve klonlamaktır. Bir gen klonlandıktan sonra hem dizisini çalışabiliriz hemde protein ürünüyle ilgili bilgiler elde edebiliriz.Örneğin CF geni mutasyonu ölümle sonuçlanan en önemli genlerden biridir.   1985te genin 7q31-q32de olduğu 4 yıl sonra klonlandığında ise hastalığın klor kanal proteinindeki bozukluk sonucu ortaya çıktığı belirlenmiştir..

5 Major strategies:hastalık genlerinin klonlanması
Functional cloning – genetik bir hastalıkta rol aldığı düşünülen bilinen bir proteinin işleviyle ilgili bilgi kullanılır. Candidate gene approach – genin olası işlevi homolojisi ve ekspresyon profilinden elde edilen bilgi kullanılarak yapılır ama kromozomal yeri bilinmez. Positional cloning –gen haritasında genin yaklaşık yeri bilindiğinde uygulanır. Positional candidate approach – haritadaki yeri olası işlevi homolojisi ve expresyon patterniyle ilgili bilgiye sahip olunduğunda kullnaılrı..

6 Figure 17.3 Genetic Diseases of Membrane Proteins
Enzim, membran reseptörleri yada membran transport proteinleri genleri mutasyona uğryaabilirler ve dolayısıyla hastalıklara neden olabilirkler. Fenilketonuri, ailesel hiperkolesterolemi, kistik fibrosis

7 Figure Prion Proteins Bazı hastalıklar yapısal proteinlerdeki mutasyonlar sonucu ortaya çıkar örneğin Duchenne Muscular Distrofi ve hemofili. Prion proteinleri yapısı değişiğinde hastalıklara neden olan proteinlerdir. Ve insandan insana geçebilirler ve geçtiği kişideki proteinin yapısını da bozar.

8 Figure 17.5 A Fragile-X Chromosome at Metaphase
Bazı hastalıklar tek bir gendeki mutasyon sonucu ortaya çıkar. Bazılarının da hastalık ortaya çıkarabilmsei için birçok genin çevre ile etkileşime girmesi gerekir. İnsandaki genetik hastalıklar farklı kalıtım modellerine sahiptir. Mutant allel otosomal resesif, otosomal dominant yada Xe bağlı olarak kalıtırlır. Bazı hastalıklarda koromozmal anomalilikler sonucu ortaya çıkar.

9 Figure 17.6 Strategies for Isolating Human Genes
Moleküler biyoloji teknikleri hastalıklardan sorumlu genlerin ortaya çıkarılmasına aracılık etmektedir. Bu yöntemlerden biri hastalığa neden olan genin mRNA sını izole etmek ve sonra da bir gen kütüphanesi içeriisnde bu mRNA’yı üreten geni bulmaktır. Kromozom delesyonu olan bir hastadan elde edilen DNA normal bir bireyin DNA sı ile karşılaştırılarak kayıp gen bulunabilir.

10 Figure RFLP Mapping Pozisyonal klonlama: genetik markerlar geni bulmak için rehber olarak kullanılır. Bu markerlar restriction fragment length polymorphisms (RFLP) markerlarıdır ve mutant gene bağlantı gösterebilir.

11 Figure 17.8 5-Methylcytosine in DNA Is a “Hot Spot” for Mutagenesis
En genel mutasyonlardan biri 5-metilsitozinin değişime uğrayarak timine dönüşmesidir.

12 Figure 17.9 The CGG Repeat in the Fragile-X Gene Expands with Each Generation
fragile-X chromosome etkisi her bölünmede kötüleşir. Bunun nedeni 3lü tekrar dizilerinin her bölünmeden sonra genişlemesidir.

13 Figure 17.10 Genetic Screening of Newborns for Phenylketonuria
Genetik taramalar genetik mutasyonları tanımlarlar. Bazı testler çok basittir ve fazla substratın belirlenmesi yada ürünün elde edilemeyişine göre gerçekleşir.

14 Figure 17.11 DNA Testing by Allele-Specific Cleavage
DNA test etmede iki dominant yöntem vardır. Allel spesifik kesim, allel spesifik oligonükledotid hibridizasyonu.

15 Figure 17.12 DNA Testing by Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization

16 Figure 17.13 A Cancer Cell with Its Normal Neighbors
Tümörler benign olabilir: belirli bir yere kadar büyür ve sonra durur yada malign olabilir diğer organlara yayılır ve diğer bölümlerine vücudun. En az 5 tane kanser türü viruslar aracılığıyla gerçekleşir

17 Figure 17.14 Dividing Cells Are Especially Susceptible to Genetic Damage
İnsandaki kanserlerin yüzde 85i somatik hücrelerin mutasyona uğraması sonucu meydana gelir. Bu mutasyonların çoğu bölünen hücrelerde görülür.

18 Figure 17.15 Oncogene Products Stimulate Cell Division
Normal hücreler onkogenler içerir ve bunlar mutasyona uğradıkları nda aktive olurlar ve kanseri aktive ederler. Hücre bölünmesi ni sürekli aktive eder ve hücre ölümünü de durdururlar .

19 Figure 17.16 The “Two-Hit” Hypothesis for Cancer
Yaklaşık tüm kanserlerin %10 tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonlar sonucu görülür. Bu genler hücre bölünmesini yavaşlatan genlerdir. Kanserin gelişmesi için TSG lerin iki allelinin de mutasyona uğraması gerekir. Kalıtılan kanserlerde bir kişi kalıtılan mutant allele sahiptir ve 2 . Allede somatik mutasyon meydana gelirse iki allel de bozuktur ve kanser gelişmeye başlar.

20 Figure 17.17 Tumor Suppressor Gene Products Inhibit Cell Division and Cancer

21 Figure 17.18 Multiple Mutations Transform a Normal Colon Epithelial Cell into a Cancer Cell
Mutasyonlar ya onkogenleri aktive eder yada TSG leri inhibe ederler ki malign tümör oluşturuabilsinler.

22 Figure 17.19 Strategies for Killing Cancer Cells
Genetik bir hastalığı tedavi etmenini bir yolu fenotipi modifiye etmektir. Ör: kşinin diyetini manipüle edebilir kayıp enzimin sübstratını vermemek spesifik metabolik inhibitör verekrek reaksiyonu engellemek yada yapılmayan proteni yada metaboliti dışardan vermek.

23 Figure 17.20 Gene Therapy: The Ex Vivo Approach
gen therapide, mutant gen normaliyle değiştirilir.Etkilenen hücreler uzaklaştırılır ve yeni gen eklenir ve hücreler yeniden vücuda geri verilir yada yeni gen bir vektör araclığıyla hastaya verilir.

24 Figure 17.21 Two Approaches to Sequencing DNA
Sequencing the entire human genome required sequencing many 500-base-pair fragments and then fitting their sequences back together. In hierarchical gene sequencing, marker sequences are identified and mapped on the chromosome before DNA is fragmented. These markers are then sought in the sequenced fragments and used to align them. In the shotgun approach, the DNA is fragmented and sequenced, and common markers are then identified by computer. Review Figure

25 Figure 17.22 The Human Genome
The human genome has only about 21,000 genes.

26 Figure 17.23 Is This the Future of Medicine?
The identification of human genes may lead to a new molecular medicine.

27 Figure Proteomics . İnsanlarda birçok protein yapılır hatta genlerinin sayısından daha fazla.Çünkü bir genden birkaç protein yapılabilir. Bir canlıdaki proteinlerin tümüne proteom denir.

28 Şekil 10-2. Allele specific PCR
Şekil Allele specific PCR. Bu örnekte A/T nin C/G ye transisyon mutasyonu tanımlanmaktadır. CON:conseved primerdir ve hem doğal hemde mutant allele yapışacaktır ASP allele özgü primerdir sadece normal allele yapışacaktır ASP2 sadece mutanat allele yapışacaktır. ASP1 ve CON PCR reaksiyonunds kullanıldığında DNA örneğinde en azından bir tane normal allel yoksa PCR ürünü elde edilemeyecektir. ASP2 ve CON kullanılırsa sadece mutant allel amplifiye olacaktır,

29 Bilinen Nokta Mutasyonların Belirlenmesi :Sickle Cell Anemia- Orak Hücreli Anemi
CCA beta hemoglobini kodlayan polipeptidin 6. kodonunda G bazının T bazına değişimiyle ortaya çıkar.Oksijen hemoglobinden ayrıldıktan ve dokuya verildikten sonra eritrositler içindeki beta zinciri mutant olan hemoglobin molekülü tubular bir yapı oluşturarak birbirine yapışır ve bu tübüler yapı eritrositin şeklini bozar ve kolay hasar görmelerine neden olur. Lisise kolayca uğrayan eritrositler dolaşımdan uzaklaştırılır ve anemiye neden olur. Deforme olan eritrositler ayrıca kılcalları tıkar doku hasarı ve ağrıya neden olurlar. Tanısal Yaklaşım1: ALLELE-SPECIFIC PCR PCR primerleri hedef dizisi üzerine oturduğunda bu rekasiyonda amplifikasyon meydana gelmez çünkü primerde bir baz değişimi sözkonusudur ve komplementerlik bozulmuştur. Bu mismatch primerin en ucundaki 3’ ucunda ise pcr rekasiyonu gerçekleşmez ve ürün elde edilemez.

30 Bu test için 2 ayrı PCR reaksiyonu yapılmalıdır
Bu test için 2 ayrı PCR reaksiyonu yapılmalıdır. İlk reaksiyonda CON ve ASP1 ikinci reaksiyonda ise CON ve ASP2 Eğer sadece ilk reaksiyonda ürün elde edilmişse DNA örneği normal allel için homozigottur.Eğer sadece 2. reaksiyonda ürün elde edilmişse DNA örneği mutant allel için homozigottur.ve eğer ürün iki reaksiyonda da elde edilmişse DNA örneği heterozigottur. (örneği veren kişi bu mutasyon bakımından taşıyıcıdır. Sickle cell anemi mutasyonunu belirlemek için CON primerleri seçilmiştir.Bu primerler 6. kodonda yer alan mutasyon bölgesinin aşağısına yapışır. Asp1 sadece mutant alleli çoğaltırken (mutasyon bölgesinin hemen 5’ ucuna yapışır ve A bulunan mutasyon bölgesinde biter (ki burda T ye yapışır T ise SCA de görülür. Asp2 ASP1 gibi aynı diziye sahiptir ancak ucunda C bulunur ki bu da normal allelde bulunan G ye yapışır. Tüm basamaklar şekilde gösterilmektedir.

31

32 Not: eğer ASP1 ve CON primeleri PCR sırasında kullanılırsa amplifikasyon ürünü oluşmayacaktır. Bu primerler en azından bir tane normal allelin var olmasıyla ürün verir.Bunun terside doğrudur ASP2 ve CON kullanılırsa sadece mutant allel ürünü elde edilecktir. PCR ile amplifikasyondan sonra PCR ürünleri agaroz jelde koşturulur ve görünür hale getirilirler. Deney sırasında genotipleri bilinen insanlardan alınan örneklerde test edilir (AA, Aa, aa). Bu kontroller PCR ve yapışma koşullarının uygun olup olmadığını kontrol etmek için kullanılır. Bunlar ayrıca uzunluk belirteçleri olarak ta kullnaılırlar.

33 Expected results from allele-specific PCR reactions for sickle cell anemia, showing the patterns for all three possible genotypes. CON CON CON CON CON CON+ ASP ASP ASP ASP ASP ASP2 Homozygous normal (AA) Heterozygous (Aa) Homozygous mutant (aa)

34 2.yaklaşım: ALLELE-SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE HYBRIDIZATION
Belirli nokta mutasyonları belirlemenin diğer bir yolu da allele-specific oligonucleotide hybridization (ASO) yöntemidir Uygun hibridiazyon koşulları altında sentetik kısa tek zincirli DNA veya RNA probları kullanılır. Bu problar ancak hedef DNA ile mükemmel biçimde eşleşirse birbirine yapışırlar.. Genellikle problar kovalent olarak bir kağıda bağlanmıştır. Test edilecek DNA örneği ilgili kişiden kandan izole edilir ve PCR ile SCA mutasyonu olan bölge çoğaltılır ve sonrada bu ürün 95 derecede denatüre edilirve tek zincirli PCR ürünleri hibridizasyon tamponuna konurve test stripi ile (kağıda tutturulmuş prob) yüksek sıcaklıkta inkübe edilir. Yüksek sıcaklık sadece tam tamına prob ile eşleşen PCR ürünlerini elde etmek için kullanılır. ASO yönteminde kullanılan PCR primerleri genellikle biotin ile işaretlenir ve bu biotin aracılığıyla hibridazyon sonrası ürünler görünür hale getirilir.

35 Detection of the sickle cell anemia allele by allele-specific oligonucleotide hybridization (ASO).

36 Figure 10-5(B). ASO deneylerinde kullanılan renk belirteci
Figure 10-5(B). ASO deneylerinde kullanılan renk belirteci. PCR ürünleri sadce tam tamına eşleşmiş proba bağlanacaktır. Biotin PCR Product (single-stranded) Membrane Probe Avidin Horseradish peroxidase TMB BLUE COLOR!!

37 ASP ve ASO hybridization tam olarak mutasyon biliniyorsa uygulanır
ASP ve ASO hybridization tam olarak mutasyon biliniyorsa uygulanır.Ancak kistik fibrosis gibi yüzlerce mutasyon içeren genler için bu yöntem kullanılamaz. Yaklaşık 70% i fenilalanin 508 de 3 bç lik delesyona sahip olsada en azından 800 tane diğer mutasyonda bu gende belirlenmiştir. Hastalar tüm bu mutasyonlar için nasıl taranabilir

38 1.yaklaşım: SINGLE STRANDED CONFORMATIONAL POLYMORPHISMS (SSCP) ile exon taranması
CF geninin dizi analizi tüm mutasyonların belirlenmesini sağlasada bu yöntem çok uzun ve pahalıdır. Mutasyonu taşıyan exonu belirlemek daha kolaydır sonra da eğer mutasyon belirlenmişse sadece mutasyon olan exon dizi analizine maruz bırakılır. Bu yöntem hem ucuz hemde zaman açısından kolaylık sağlar. Exonlardaki mutasyonları belirememenin bir yolu SSCP analizidir. Tek zincirli DNA öylesine katlanıp kendine özgü bir şekil alırki Watson-Crick baz eşleşmesi kuralına bağlı olarak kararlı ve kendine özgü bir yapı oluşturur .Bu yapıların electrophoretic hareketleri farklılık gösterir çünkü bunların hareketl,iliği uzunluklarına ve konformasyonuna göre değişirSıkı sıkya katlanmış bir yapı daha gevşek bir yapıdan daha hızlı hareket eder. SSCP yapmak içingenin tüm exonları ekzonlara özgü primerler aracılığıyla amplifiye edilir ve PCR ürünleri daha sonra denature edilir ve ani biçimde soğuğa maruz bırakılarak kendi üzerlerine yapışsınlar komplementerlerine yapışmasınlar. Bu zincirler daha sonra non denature poliakrilamid jelde koşturulurlar. Poliakrilamid en küçük harkeet farklııklarını ayırt etmek için kullanılır (agaroz jelde bunedenle koşturulmaz),

39 SSCP analizi. The exact type/location of the exon cannot be determined from SSCP, so the assay is generally followed by sequencing of the mutant exon. (A heterozygote would show all four bands in the same lane.) Homozygous for normal allele Homozygous for mutant allele Herbir normal örnek iki ayrı band içermesi beklenir çünkü bağımsız olarak 2 komplementer DNA zinciri katlanmıştır. Analiz edilen exonda beklenen mutasyon açısından bulunan 4 tane bantlı örnekler heterozigot, ve 2 bantlı örnekler bu mutasyon açısından homozigottur. Bu mutant bantlar normal allelden farklı bir konformasyona sahip olduklarından jel üzerinde farklı yere göç edeceklerdir.

40 2.yaklaşım: DNA Dizi Analizi
Mutasyon exonda belirlendikten sonra mutant ekzon mutasyonun yeri ve hangi bazda değişimin meydana geldiğini öğrenmek için DNA dizi analizi gerekir. DNA dizi analizi genellikle Sanger Metodu, ile yapılır ve bu yöntemde dideoxy (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) nucleotidler kullanılır. Bu yönteme bu nedenle dideoxy sequencing de denir. Dideoxynucleotidler özel olarak sentelenmiş şekerin karbonuna bağlı 2’ ve 3’ OH gruplarını kaybetmiş nükleotidlerdir.

41 Büyük delesyonların belirlenmesi: Duchenne Muscular Dystrophy DMD
DMD ye neden olan mutasyonların çoğu büyük delesyonlardır ve mRNAda çerçeve kaymasına neden olurlar ve çoğunlukla bu delesyonlar kısa işlevsel olmayan DMD polipeptitleriyle sonuçlanır.

42 1.yaklaşım: PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT)
PTT revers transkripsiyonla başlar (RT-PCR). BU reaksiyonda kas biyopsi örneğinden (ki bu dokuda çokça distrofin proteni yapılması beklenir) mRNA izole edilir ve cDNA (single stranded komplementer DNA) ya dönüştürülür ve sonra da PCR ile amplifiye edilir (Not: cDNA intronik DNA taşımaz) Bu cDNA daha sonra in vitro transkripsiyon/translasyon reaksiyonuna tabi tutulur. Bu reaksiyonda RNA polimeraz ve ribozomlar bulunur.Radyoaktif işaretli sülfür marker olarak kullanılır dolayısyla reaksiyonda sentezlenen polipeptideler görünür hale getirilir. Translasyon sonrası işaretli polipeptidler SDS-PAGE ile koşturulur (protein jel electrophorezi) ve jelin X-ray filmine maruz bıraklılmasıyla da görünür hale getirilir.

43 Figure 10-9. DMD de PTT sonuçları. 4. örnek DMD hastasına aittir.

44 2.yaklaşım: MULTIPLEX PCR
Distrofin geni çok büyük bir gendir (2 x 106 bp) bu geni amplifiye etmek için bir PCR reaksiyonu yetmez (PCR ile genelde 2000 bç uzunluktaki fragmentler çoğaltılır.) Ancak bir kaç primer seti farklı ekzonları çoğaltmak için kullanılırsa PCR ile bu gen mutasyon yönünden etkin biçimde taranabilir. Genellikle aynı anda birkaç reaksiyon aynı PCR tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu tür deneye multiplex PCR denir.

45 (A) 10 DMD hastasında distrofin geninin 43-60
(A) 10 DMD hastasında distrofin geninin exonlarının multiplex PCR sonuçları 7 ve 9 nolu örneklerde delesyon vardır. Diğer hastalar bu bölgede farklı yerlerde delseyona sahiptir (B).

46 V. DETECTION OF MUTATION PROFILES IN SOMATIC TISSUE: BREAST CANCER
Tümörler birçok mutasyona sahiptirler. Ve herbir tümörün profili kendine özgüdür. Tümör dokusundaki mutasyonları belirlemek doktorların hastalara daha doğru tanı koymasına ve tümöre özgü uygun tedavi yöntemini uygulamasına yardımcı olur.

47 yaklaşım: DNA MICROARRAYS
DNA microarray nokta biçiminde harketsizleştirilmiş yüzlerce tek zincirli DNA dizinin cam üzerine yerleştirildiği minyatür aygıtlardır. Bu aygıtlar aynı zamanda high density oligonucleotide chips, olarak adlandırılır ve simültane biçimde birçok mutasyonun belirlenmesini sağlar. Bir meme kanseri hastasından biyopis örneğini analiz etmek için moleküler tanı labı tipik olarak bir mikroarray kullanır.. Bu mikroarray normal meme dokusundan elde edilen mRNA kullanılarak elde edilmiştir ve bu mRNA normal bir meme dokusundan eksprese olan tüm genleri temsil eder.Biyopsi materyalinin mRNA popülasyonu florasan bir boya ile boyanır (ör:mavi) ve farklı bir renkle boyanarak işaretlenmiş normal meme dokusundan elde edilen mRNA ile karıştırılır (sarı) . Karışmış mRNA popülasyonu daha sonra mikroarray çipine hibridize edilirve laser tarayıcı tarafından taranarak array üzerindeki sinyal floresan renkler okunur ve amplitude, dalga boyu ve loksayonu kaydedilir Kanser dokusundaki mavi renkli floresan verir çünkü kanser mRNAları çip üzerndeki normal mRNAlar ile yarışa girer.Fazla ekpsrese olan genler Genes that are overexpressed (i.e. abnormally upregulated) in the cancer tissue will fluoresce blue, because the cancer mRNAs will outcompete the normal mRNAs at that site on the chip. Az ekpsrese olan genler ise sarı renk verir. Heriki sinyal de önemlidir.Çünkü meme kanserinde birçok gen upregüle olur (ör:onkogenler). Diğer genlerden bazıları da tamamen ekpsresyonları durur (ör:tümör baskılayıcı genler). Çip üzerinde yeşil boyanan kısımlar dikkate alınmaz çünkü bu genler hem normal hemde kanserli dokuda eşit oranda ekzprese olmuşlarıdr.

48 Figure Competitive DNA micorarray assay to compare gene expression profiles for two distinct mRNA populations.