TANISAL MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ Dr.Hüsnü PULLUKÇU.

... konulu sunumlar: "TANISAL MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ Dr.Hüsnü PULLUKÇU."— Sunum transkripti:

1 TANISAL MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ
Dr.Hüsnü PULLUKÇU

2 Plazmit analizi DNA dizi analizi Ribotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu Ligaz zincir reaksiyonu MTD HBV DNA hibridizasyon HPV DNA ve tiplendirme

3 MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLER
HIZLI DUYARLI TANI KOYDURUCU PAHALI LABORATUVAR DONANIMI DENEYİMLİ PERSONEL

4 TEMEL BASAMAKLAR HİBRİDİZASYON TEKNİĞİ AMPLİFİKASYON TEKNİĞİ

5 HİBRİDİZASYON Klinik örnekte bulunan etkenin genomik yapısının ayrıştırılarak kendisine uygun nükleik asit probu ile bağlanması

6 NÜKLEİK ASİT PROBLARI Aranan etkenin genomik yapılarına özgül ve duyarlı DNA yada RNA hedeflerle hibridizasyon Yüksek spesifiklikle hedef nükleik asite komplementer bağlanma ’lerce baz çift uzunluğu Oligonükleotitler 50 baz çiftten kısa hedef moleküllere daha hızlı bağlanma

7 HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ
Katı fazlı hibridizasyon Dot blot Southern blot Northern blot Sıvı fazlı hibridizasyon İn-situ hibridizasyon

8 İNSİTU HİBRİDİZASYON-1

9 İNSİTU HİBRİDİZASYON-2

10 İNSİTU HİBRİDİZASYON-3

11 AMPLİFİKASYON TEKNİKLERİ
Prob amplifikasyonu QB replikaz Ligaz zincir reaksiyonu Sinyal amplifikasyonu branched-DNA (Dallanmış problar) Diğer (enzim, radyoizotop, florokrom boya arttırımı) Hedef nükleik asitin çoğaltılması PZR (polimeraz zincir reaksiyonu) TMA (transkripsiyon aracılı çoğaltma) SDA (İplikçik uzaklaştırarak çoğaltma)

12 PROB ÇOĞALTILMASI Testin temel basamağı ortama eklenen
probların çoğaltılması QB replikaz LZR (Ligaz zincir reaksiyonu)

13 QB REPLİKAZ

14 LİGAZ ZİNCİR REAKSİYONU

15 SİNYALLERİN ÇOĞALTILMASI
Hedef nükleik asite bağlanmış olan enzim, florokrom boya, radyoizotop gibi işaretlerin çoğaltılması Fazla sayıda enzim, fazla sayıda prob İkinci sıra enzim ve prob Dallanmış DNA (branched DNA) HBV-DNA hibridizasyon

16 DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-1

17 DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-2

18 DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-3

19 HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-1

20 HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-2

21 HEDEF NÜKLEİK ASİTLERİN ÇOĞALTILMASI
Örnekte az sayıda bulunan mikroorganizmalara ait nükleik asitlerin saptanması Kantitatif olarak uygulamak mümkün PZR ( Polimeraz zincir reaksiyonu) MTD ( M.tuberculosis Direkt Test)

22 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU

23 TMA (Transkripsiyon Aracılı amplifikasyon)

24 SORUNLAR Nükleik asit kontaminasyonu İnhibitör maddeler
Standardizasyon yok Yüksek maliyet Yanlış tetkik istemleri