MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ

... konulu sunumlar: "MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ"— Sunum transkripti:

1 MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ
Dr. Fahri ŞAHİN Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

2 MKH ÜRETİMİ ve SORUNLAR

3 Sorunlar Örnek alımı MNH eldesi Kültüre etme Tripsinizasyon Pasaj
Tanımlama / Diferansiyasyon Etik / Yasal sorunlar

4 Örnek Alımı Kemik İliği Spongioz Kemik Kortikal Kemik

5 İnkübasyon Nonadheren hücrelerin atılması 48-72 saat inkübasyon
Fikol KİA MNH tabakası Plazma Fikol Eritrosit Santrifüj 800g 20 Dak Yıkama 48-72 saat inkübasyon Taze BY Nonadheren hücrelerin atılması İnkübasyon

6

7 Tripsinizasyon Tripsin - EDTA 5 dk İnkübasyon

8

9 Tripsin blokajı ve yıkama
Serum içeren Media veya PBS 800G 10 dk Tekrar kültür ve tripsinizasyon ile 2-6 pasaj

10 FBS Son yıllara kadar MKH lerin in vitro ekspansiyonu için 10 % FETAL BOVİNE SERUM (FBS) kullanılıyordu Virüs, bakteri, prion bulaşı İmmün veya lokal inflamatuar reaksiyonlar Engrafman yetmezliği, rejeksiyon Otolog serum kullanımını gündeme getirmiştir

11 Proliferasyon : C > D = B > A
%1 OS C D %3 OS %10 FBS %10 OS Proliferasyon : C > D = B > A Osteojenik Dif. : C +++ > D ++ > B + > A 0 Adipojenik Dif. : D +++ > C ++ > B + > A 0 Norbert Stutea et al. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004 (Hamburg, Germany)

12 Türler arasında farklılık
İnsan, sıçan ve tavşanda MKH üretim nispeten kolay Farede üretim oldukça sıkıntılıdır

13 Farelerin 5-florourasil ile muamelesi
CD11b’ ye karşı antikor ile immündeplesyon BY değişikliği: DMEM yerine α-MEM Düşük glukoz içerikli BY

14 Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü
Flowsitometrik değerlendirme CD11b, CD31, CD34 ve CD45 negatif SH2 (CD105), SH3 veya SH4 (CD73), CD117 (c-kit), CD90 (Thy-1) ve STRO-1 pozitif

15 Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü
2. Diferansiyasyon özelliğinin değerlendirilmesi * Osteojenik diferansiyasyon * Kondrojenik diferansiyasyon * Adipojenik diferansiyasyon

16 Osteojenik Diferansiyasyon
Alkalen fosfataz aktivitesi

17 Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu
Beyaz ok : osteoblastik kolonide ALP border. Siyah ok: Apatit mineralizasyonu (X-ray) Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu von Kossa boyası

18 Kondrojenik Diferansiyasyon
Mikropelet kültürde, Kartilaginöz proteoglikanların pozitifliği. Gümüş mavisi boyası Safranin O boyası

19 Adipojenik Diferansiyasyon
Lipidden zengin vakuollerin intraselüler birikimi Oil-Red O boyası

20 Good Manufacturing Practice
GMP

21

22 For Tissue Engineering……
That is not dead which can eternal lie, And with strange aeons even death may die Howard Lovecraft Sonsuzluğa uzanabilen ölüm değildir Ve garip sonsuzluklarda ölüm bile ölebilir This is not the end This is not even the beginning of the end But it is the end of the beginning Winston Churchill