Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı

... konulu sunumlar: "Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı"— Sunum transkripti:

1

2 Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı
Kandaki bakteriyel ve fungal DNA’ nın doğrudan tespiti için, multiplex real-time PCR testi kullanan temel klinik bir çalışma Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı

3 Sepsis; birçok sistemi tutan, hemodinamik değişikliklere yol açan; şok, organ fonksiyon bozukluğu ve organ yetmezliğine kadar gidebilen ölümcül bir infeksiyon hastalığıdır Bakteremi; canlı bakterilerin dolaşımda bulunmasıdır, tanısı kültür pozitifliği ile konur

4 Bakteremi ve fungeminin hızlı tespiti bakteriyoloji laboratuvarının en önemli görevlerinden birisidir Mikrobiyolojik raporlandırma , tedavi yeterliliğine ek olarak sepsis anındaki tedavi stratejisinin başarısı için de hayati öneme sahiptir

5 Mikrobiyal raporlama mortalite ve morbidite üzerinde büyük bir etkiye sahiptir
Örneğin, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus kaynaklı infeksiyonlar için sepsisin hızlı ve somut tedavisi önerilmektedir

6 Geleneksel kan kültürü (KK) den elde edilen sonuçlar, şüpheli infeksiyonun başlangıcından itibaren saat içerisinde genellikle tespit edilemezler, bu durum ampirik tedavinin başlanmasını gerektirir

7 Sepsis şüphesinin ilk 24 saati süresince, antibiyotik tedavisinin vakaların %10-60’ ında uygun olmadığı bildirilmektedir(yani ,seçilmiş antibiyotiklere dirençli bir veya daha fazla sayıda patojen tespit edilmiştir)

8 Uygun olmayan antibiyotik tedavisi, yoğun bakım ünitelerinde(YBÜ) ortaya çıkan antibiyotik direnci ile birlikte %10-45’lik bir mortalite oranıyla ve daha uzun hastane kalımıyla ilişkilendirilmiştir

9 Etken patojenlere yönelik olarak antibiyotik tedavisinin hedeflenmesi direnci azaltmada önemlidir
Ama, potansiyel patojenlerin tespiti için, daha hızlı ve duyarlı tanı koyucu araçlar daha doğru ve uygun antibiyotiğin seçimi için gereklidir

10 Erken şüphelenilen sepsisli hastaların kanında bakteriyel ve fungal DNA’ nın doğrudan belirlenmesi ve tespit edilmeye başlanması uygun antibiyotik tedaviyi belirleme şansını doğurmuştur Bu durum ilaç maliyetlerinin düşmesine, daha kısa tedavi süresine,hastanede daha kısa süre kalmaya ve tüm direnç oranlarında azalmaya yol açabilir

11 Yoğun bakım ünitelerine kabul edilen hastaların kanındaki tüm infeksiyonların %90’ nına neden olan 20 en önemli bakteriyel ve fungal türü kandan doğrudan tespit etmek için LİGHT CYCLER SeptiFast( LC-SF) testi geliştirilmiştir

12 Mevcut çalışma, günlük uygulamada geleneksel kan kültürü ile kıyaslanan bu multiplex real-time PCR kitini kullanan ve kanlarında şüpheli infeksiyonla YBÜ’ ye kabul edilen hastalarla gerçekleştirilmiş prospektif ve gözleme dayalı bir çalışmadır

13 MATERYAL-METOD Bu prospektif gözleme dayalı çalışma, 6 aylık bir sürede 30 yataklı bir YBÜ’ de gerçekleştirilmiştir Ateşi (>38°C) veya hipotermisi (<36°C) olan bütün yetişkin hastalar uygun bulunmuş Klinik veriler YBÜ’de gelişmiş ve tüm hastane kalımı süresince prospektif olarak toplanmıştır

14 KAN KÜLTÜRÜ Kan örnekleri tek bir venden alınmış (her bir KK için 10 ml) KK’leri yapılırken; aerobik ve anaerobik kan kültürü şişeleri (Bact/Alert,bioMerieux,Marcy I’Etoile,France) 37°C’de 5 gün inkübe edilmiş, mantar kültürü için kullanılan mycosis medyum şişesi ise (BACTEC 9200, BD,Point-de-Claix,France) 37°C’de 14 gün süreyle inkübe edilmiş

15 LC-SF Testi LC-SF testi 3 basamakta gerçekleştirilmiştir;
( i) mekanik liziz ve DNA ayrıştımasıyla birlikte numune hazırlanması; ( ii) üç paralel reaksiyonda(Gram-pozitif bakteri, Gram-negatif bakteri ve mantarlar) hedef DNA’nın real-time PCR amplifikasyonu ve özel hibridizasyon problarıyla tesbit edilmesi (iii) türlerin ve kontrollerin otomatize tanımlanması

16 LC-SF testiyle tespit edilen hedef numuneler Tablo 1’de gösterilmektedir
DNA hazırlanması için 1,5 ml tam kan kullanılmış PCR ürünlerinin real-time tespiti LightCycler 2.0 aracı kullanılarak gerçekleştirilmiş Numunelerin erime sıcaklığı ve kontroller, LC-SF tanımlama yazılımı kullanılarak analiz edilmiş, ve bir rapor düzenlenmiştir

17

18 İstatiksel Analiz Veri analizleri için SPSS yazılımı (Windows için SPSS, versiyon 14.1; SPSS, Chi­cago, IL, ABD) kullanılmış Pozitif KK sonuçlarına sahip hastalar ile negatif KK sonuçlarına sahip hastalar arasındaki demografik verileri karşılaştırmak için Mann–Whitney U-testi kullanılmıştır

19 SONUÇLAR 72 hastadan peşpeşe alınan toplam 100 tane KK (aerobik, anaerobik ve fungi) ve LC-SF numuneleri incelenmiş Negatif KK sonucuna sahip hastalar ile pozitif KK sonucuna sahip hastalar arasında YBÜ’ne kabulu için sebepler veya demografik veriler bakımından anlamlı düzeyde istatistiksel farka rastlanmamıştır (p >0.05)

20 En çok şüphelenilen infeksiyon bölgesi solunum yollarıydı;negatif KK sonuçlarına sahip numunelerin %66’sı (59/90) ve pozitif KK sonuçlarına sahip numunelerin %70’inde (7/10)

21 Kanın alınışından LC-SF sonuçlarının elde edilişine kadar geçen süre 7 ile 15 saat arası değişiklik göstermiştir Tablo 2, 100 tane eşleştirilmiş numuneye ait 102 tane sonucu göstermektedir Altı hastada, KK tek başına pozitifmiş, Staphylococcus epidermidis kan alımında meydana gelen bir kontaminant olarak kabul edilmiştir

22

23 LC-SF ile belirlenen pozitif vakaların sonuçları Tablo 3’te verilmiştir
Sadece KK’lerinde görülen LC-SF testiyle belirlenemeyen iki tane maya mantarı vardı: Candida glabrata/S. aureus (hasta 4) ve Candida albicans/Candida tropicalis (hasta 9). İlk vakada, C. glabrata LC-SF testinden 5 gün önce boğaz ve idrardan elde edilmiş, ikinci vaka için, C. albicans LC-SF testinden 15 gün önce bronşiyal salgılardan izole edilmiştir

24

25 LC-SF’nin sonuçlarının KK’den elde edilenlerle karşılaştırılmasında, testin analitik performans parametreleri aşağıdaki gibi tespit edilmiş: duyarlılık, özgüllük, pozitif prediktif değeri (PPV) ve negatif prediktif değeri (NPV) sırasıyla %40, %88, %27 ve %93 şeklindeydi

26 Sekiz hastada, organizmalar LC-SF testi kullanılarak belirlenmiş, fakat bu hastaların KK sonuçları negatifti (Tablo 3) LC-SF ve mikrobiyolojik verilerin sonuçları esas alındığında üç hastanın (hasta 2,3 ve 6) antibiyotiği değiştirilmiş Bu hastaların iki tanesinde (hasta 3 ve 6) ilk tedavinin yetersiz olduğu düşünülmüştür

27 Antbiyotik almayan 2. hasta LC-SF sonucunun (E
Antbiyotik almayan 2. hasta LC-SF sonucunun (E. coli) pozitif olması yüzünden altıncı gün antibiyotik almaya başlamış 5. hastada antibiyotik tedavisi yeterli olduğu düşünülmesine rağmen, kateterin enfeksiyon kaynağı olabileceği düşünülerek, LC-SF testinin ardından kateter çıkarılmış Pozitif LC-SF sonuçlarına sahip dört hasta (hasta 1,4,7 ve 8) LC-SF testi döneminde zaten antibiyotik alıyorlardı ve antibiyotik rejiminde değişiklik yapılmamıştır

28 Tablo 3’de ilk tedavinin dört hasta için yetersiz olduğu ve antibiyotik rejiminin bu hastalar için değiştirildiği gösterilmektedir

29 11 farklı vakadan (Tablo 3; dokuz tane LC-SF pozitif/KK negatif, iki tane LC-SF pozitif/KK farklı) on tanesinin gerçek-pozitif sonuçları olduğu kabul edilmiş,yani klinik bulgular ve diğer mikrobiyoloji sonuçlar pozitifmiş Ayrıca, LC-SF sonuçları negatif fakat KK sonuçları pozitif olan iki numune sonuç olarak klinik bakımdan anlamlı bulunmamış (Tablo 2). Bundan dolayı, LC-SF performansı aşağıdaki gibi belirlendi: duyarlılık %78; özgüllük %99; PPV %93; NPV %95

30 TARTIŞMA LC-SF testi önceden inkübasyona ihtiyaç duyulmadan doğrudan kanda mikroorganizmaları belirlemek için kullanılan ilk DNA bazlı testtir Bunun gibi bir test, sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların tedavisini optimize etme potansiyeline sahiptir

31 Mevcut çalışmada bakteremiden iyileşme oranı, LC-SF testiyle elde edilen sonuçlara göre yapılan tedaviyle, KK’den açık bir şekilde daha iyiymiş

32 Ancak, bu sonuçlar üç tane soruyu ortaya çıkarmıştır: (i) Sadece LC-SF testinde belirlenen izolatların klinik uygunluğu nedir; (ii) PCR tarafından bulunan DNA’ nemi gerçek infeksiyonu yansıtır mı; ve (iii) KK ve DNA-bazlı testler arasında bunun gibi bir karşılaştırma için en iyi tasarım nedir?

33 Subklinik bakteriyel infeksiyonlara sahip hastalarda bile kanda dolaşan bakteriyel DNA’nın varlığına dair literatürde hiçbir çalışma yoktur

34 Mevcut çalışma esas olarak KK setinin sayısıyla ilgili bazı kısıtlılıklara sahiptir
Aslında, KK’lerin duyarlılığı daha büyük miktarda kanın kültürlenmesi yoluyla arttırılırken, LC-SF testi sadece üç tane aynı zamanda toplanmış KK’den oluşan bir setle karşılaştırılmıştır

35 Ancak, bu gibi bir moleküler testin amacı, numune sayısını azaltırken muhtemel en iyi duyarlılığı elde etmeye çalışmaktır

36 Diğer bir özellik sirküle eden cansız bakteri ve fungilerin, mesela antimikrobiyallerin inhibite ettiği bakterilerdeki veya fagositik hücrelerin içindeki DNA’ nın amplifikasyonudur PCR-bazlı metotlar KK’den daha duyarlıdır

37 Aslında, bakterilerin sadece LC-SF testiyle belirlendiği 11 vakada sonuçların yanlış pozitif olduğu varsayılabilir Ancak, bu vakalardaki klinik bulgular ve diğer veriler arasındaki ilişki, iyileştirilen bakterinin hastanın durumundan gerçekten sorumlu olduğunu düşündürmektedir

38 Bundan dolayı, gelecekte KK artık kan dolaşımı infeksiyonlarının teşhisinde referans standart olmamalıdır Bu konuyla ilgili yayınlar arasında, yakın geçmişte yapılan bir çalışma, yanlış-pozitif kan kültür şişelerinin otomatik sistemlerle belirlendiğinin ve bu şişelerde mikrobiyal DNA değerlendirmesini önerdiğinin altını çizmektedir

39 İyice anlaşılmıştır ki, uygun antibiyotik tedavisinin zamanında başlanmasının mortalite üzerinde önemli bir etkisi vardır LC-SF testi klinikçilere daha önce mümkün olandan çok daha erken ve iyi kalitede bir terapötik yönetim fırsatı sağlamaktadır

40 Bu bir ön çalışma olduğu için, pozitif KK ve/veya LC-SF sonuçlarına sahip hastaların sayısı çok azdı
Ancak, vakaların bir kısmında tedavi rejimi, LC-SF sonuçlarına ve diğer mevcut klinik bilgilere göre değiştirilmiştir

41 LC-SF testinin klinik uygunluğu KK sonuçlarında olduğu gibi klinikçiler tarafından belirlenmiştir
Kontaminasyon ihtimali, otomatik real-time PCR gibi teknik gelişmelere bağlı olarak önemli oranda azalmıştır

42 Bununla birlikte, bu çalışmada bir vakada kontaminasyon görülmesine rağmen Louie ve ark. tarafından gerçekleştirilen çalışmada sekiz vakada kontaminasyon (S. epidermidis) bulunmuştur

43 Doktorların mikrobiyolojik sonucu numune alındığı gün elde etmesi infeksiyonların tedavisinde ileri bir adım olacaktır LC-SF testi gibi PCR bazlı bir testten elde edilen bir sonuç tek başına değil klinik önemi mevcut klinik ve diğer laboratuvar verilerini dikkate alarak yorumlanmalıdır

44 Bu ön çalışmadan elde edilen sonuçlar LC-SF testinin klinik olarak sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların optimal tedavi yönetiminde değerli bir tamamlayıcı araç olabileceğini öngörmektedir

45 Sepsisi olan hastalarda sebep olan etkenlerin geleneksel kültür-bazlı metotlara ilaveten , LC-SF testini kullanarak saptanmasının, klinik faydaları ve nihai sağlık- ekonomik alandaki faydalarını değerlendirmek için daha büyük, çok merkezli, randomize kontrollü çalışmalar gereklidir