BAKTERİYOFAJLAR Prof.Dr.Ömer POYRAZ.

... konulu sunumlar: "BAKTERİYOFAJLAR Prof.Dr.Ömer POYRAZ."— Sunum transkripti:

1 BAKTERİYOFAJLAR Prof.Dr.Ömer POYRAZ

2 BAKTERİYOFAJLAR Bakteri virüsleri olarak da bilinen bakteriyofajlar, bakterilerin zorunlu parazitleri olup, yalnızca canlı bakteri hücreleri içinde çoğalabilirler. Bakterilerle olan ilişkileri sonucunda çoğu zaman bakterilerin parçalanarak erimesine yol açarlar. Bakteriyofajlar genellikle belirli tür veya belirli tip bakterilere karşı özgül ilişki gösterirler. Yani bir bakteriyofaj tipi yalnızca kendisine uygun olan bakteri türünü enfekte edebilir. Bunun yanında bir tür bakteri, birden çok bakterinin üremesi için konak vazifesi görebilir. Üzerinde en fazla çalışılan fajlar E.coli, B.subtilis ve Pseudomonas’lara ait fajlardır.

3 Yapısal Özellikleri Çeşitli tipte ve görünümde fajlar bulunmakta olup, kompleks bir fajda baş, boyun, kuyruk ve kuyruk fibrilleri bulunmaktadır. Baş kısmı yaklaşık 80x110 nm boyutlarındadır Baş kısmının ortasında nükleik asitten oluşmuş bir faj genomu vardır. Nükleik asit tipi fajların çoğunda DNA, az bir kısmında ise RNA' dan oluşmaktadır. Nükleik asitler virüslerde olduğu gibi tek veya çift iplikcikli olabilirler. Nükleik asidin etrafında ise yine virüslerde olduğu gibi kapsit adı verilen protein bir kılıf bulunur. Nükleik asit ve kapsidten oluşan bu yapıya nükleokapsid adı verilir.

4 Yapısal Özellikleri Fajlarda baş kısmını kuyruk kısmına bağlayan kısa bir boyun kısmı bulunur. Kuyruk yapısı bakteriyofaj tiplerine göre farklılıklar gösterir. Bazı faj türlerinde hiç kuyruk bulunmazken, yani yalnızca baş kısmından oluşurken, bazılarında çok kısa ve basit yapılar şeklinde, bazılarında ise oldukça kompleks görünümde olabilirler. Kompleks bir fajın kuyruğunun yüzeyinde kasılabilir örtü ve kuyruğun alt kısmında ise taban organeline bağlı olarak bulunan kuyruk fibrilleri yer alır. Kuyruk yaklaşık 25x110 nm boyutlarındadır. Kuyruk kısmı bakteriyofajlarda yapışma veya adsorbsiyon organeli olarak görev yapar. Genetik maddenin bakteriye transferinde bir kanal ya da köprü vazifesi görür. Kuyruk kılıfının kasılması sayesinde genetik madde kuyruk içerisinden bakteriye nakledilir

5 Kompleks Bir Fajın Şematik Görünümleri

6 Bakteriyofajların Elektron Mikroskopundaki Görünümü

7 Fajların Sınıflandırılması
Elektron mikroskopla yapılan çalışmalarda bakteriyofajların morfolojik yapıları hakkında ayrıntılı bilgiler elde edilmiştir. Bu amaçla genellikle E.coli’’ye ait fajlardan yararlanılmıştır. Bakteriyofajlar morfolojik ve diğer karakter-leri göz önüne alınarak çeşitli sınıflandırmalara tabi tutulmuşlardır. Bunlardan en önemlileri Bradley ve Ackermann sınıflandırmasıdır.

8 Bradley Sınıflandırılması
Bu sınıflamaya göre fajlar baş ve kuyruk özelliklerine göre 6 grup altında toplanırlar. A tipi faj : Kasılabilen kılıflı, kuyruklu fajlar. B tipi faj : Uzun kuyruklu, kılıflı fajlar. C tipi faj : Kısa kuyruklu, kılıfsız fajlar. D tipi faj : Kuyruksuz, büyük kapsomerli fajlar. E tipi faj : Kuyruksuz, küçük kapsomerli fajlar. F tipi faj : Başsız, ipliksi ya da filamentöz fajlar.

9 A Tipi Faj Tam kompleks fajlar bu grupta yer alır.
Bunlarda baş, kuyruk, etrafında kasılabilir kılıf, kuyruk tabanı, kuyruk fibrilleri gibi organeller bulunur. Baş kısmında çift iplikçikli ve lineer DNA molekülü yer alır.

10 B Tipi Faj Bu fajlarda uzun kuyruğun etrafında kasılabilir kılıf bulunmaz Baş kısmı içinde çift iplikçikli lineer bir DNA molekülü vardır. Kuyruğun distal ucunda taban organeli, iğne, fibril gibi organeller bulunmaz

11 C Tipi Faj Baş kısmı tip A ve tip B’ye benzer
Bunlarda kasılabilir kılıfı olmayan kısa kuyruk bulunur Baş kısmında çift iplikçikli lineer DNA molekülü bulunur Kısa olan kuyruğun distal olan ucunda taban organeli, iğne ve fibril bulunmaz

12 D Tipi Faj Bu gruptaki fajlar kuyruksuz olup ikozahedral simetri yapısı gösterirler. Kapsidlerinde bulunan kapsomerler büyüktür. Kendileri ise çok küçük olup (25 nm ), tek iplikçikli çembersel DNA molekülüne sahiptir.

13 E Tipi Faj Bu gruptaki fajlar morfolojik olarak tip D’ye benzerler
İkozahedral simetri yapısı gösterirler. Kapsidlerinde bulunan kapsomerler küçük boyuttadır. Yapısındaki nükleik asit RNA olup, tek iplikçikli, linear yapıdadır.

14 F Tipi Faj İpliksi yapıda fajlar olup, baş ve kuyruk gibi organelleri bulunmaz. Tek iplikçikli lineer DNA ihtiva eder.

15 Ackermann Sınıflandırması
Bu sınıflandırmad morfolojik karakter-leri yanında diğer bazı özellikler de dikkate alınır. Buna göre fajlar 4 temel gruba ayrılır 1 – Kuyruklu fajlar 2 – Kübik simetrili fajlar 3 – Flamentöz fajlar 4 – Pleomorfik fajlar

16 Fajların Serolojik Özellikleri
Fajlar antijenik yapıda olup, antifaj serumlar tarafından nötralize edilirler Fajların bu karakterleri ile konak bakterinin antijenik özellikleri arasında bir ilişki yoktur. Fajlar yapı özellikleri nedeniyle antijenik yönden birbirinden farklıdırlar. Buna rağmen bazı fajlar arasında çapraz reaksiyonlar olabilir Bir faj yapısında antijenik farklı moleküller bulunabilir. Bunlar fajın farklı bölgelerine yönelik hazırlanan antiserumlar ile birleşirler. Genelikle baş ve kuyruk proteinleri farklı antijenik molekül içerirler. Antifaj serumlar faj partiküllerini aglutine ederken, yüzeylerinde faj adsorbe eden bakteriler de aglutine olurlar

17 Çoğalmaları Bakteriyofajlar konak bakteri yönünden oldukça seçicidirler. Her fajın içinde çoğalabileceği spesifik bir bakteri konağı bulunur. Bakteriyofajların da virüslerde olduğu gibi çoğalma safhaları bulunur. Bunlar adsorbsiyon, penetrasyon, bakteri içinde gelişme dönemi, olgun fajların meydana gelmesi ve fajların serbest kalması safhalarıdır.

18 Adsorbsiyon Bu dönem fajın bakteri yüzeyine tutunduğu yani, bakteri içine girmek için yapıştığı dönemdir. Fajların bakteriye bağlanması kuyruklu olanlarda kuyruklarla, diğerlerinde ise fajın yüzeyindeki reseptörlerle sağlanır. Bir bakteri yaklaşık 300 kadar fajı yüzeyine adsorbe edebilir. Bu bağlanma konak bakterinin fizyolojik durumuna ve fajın türüne göre değişebilir. Aktif üreme döneminde olan çoğu bakteriler fajları daha fazla düzeyde adsorbe ederler. Buna karşın bazı fajlar bakterilerin üremelerinin durma döneminde daha etkilidirler. Bakteri yüzeyinde bulunan pilus, teikoik asit, flagella, lipoprotein, protein, lipopolisakkarit molekülleri ve hücre duvarının diğer bazı bölgeleri faj adsorbsiyon noktaları ya da reseptörleridir.

19 Adsorbsiyon Kuyruklu fajlar kuyruklarındaki fibriller, kuyruk iğneleri ve kuyruk tabanı ile adsorbe olurlar. Bu bağlanmada önce fibriller, sonra iğneler ve kuyruk tabanı bakteriye tutunur. Kuyruksuz olanlar veya ipliksi fajlar bakteriye direkt temasla adsorbe olurlar. Bakteri yüzeyindeki faj reseptör bölgeleri kendi fajı ile antijenik ilişkiye sahip olduğundan ancak kendisine bu yönden homolog olan fajları adsorbe edebilirler. Bu durum gerek bakteri gerekse faj tiplendirmesinde işe yarar. Adsorbsiyonun ilk basamağında bakteri yüzeyi ile faj arasındaki ilişki geriye dönüşümlüdür. Adsorbsiyondan sonra zaman geçtikçe bu bağlanma kuvvetlenerek geriye dönüşümsüz hale gelir.

20 Adsorbsiyon Bakterilerin yüzeyel antijenik yapısı ile faj adsorbsiyonu arasında çok sıkı bir ilişki vardır. Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde bu yüzey antijenik özellikleri farklı olduğu için fajları da farklıdır. Bakterilerin yüzeyel yapıları Vi antijenleri, kapsül antijenleri ve mukoid tabaka ile örtülü olabilir. Mukoid tabaka ve kapsül yapıları genellikle faj adsorbsiyonuna engel olurlar. Bazı fajlarda bulunan depolimerizan enzimler kapsülü ayrıştırabilir ve adsorbsiyonu kolaylaştırabilirler. Yüzeylerinde özel reseptörleri olmayan veya bu reseptörleri sentezlemeyen mutant bakteriler spesifik fajlara karşı dirençlidirler.

21 Adsorbsiyon Aşamasının Görünümü

22 Penetrasyon Adsorbsiyondan kısa bir süre sonra faj nukleer materyali hücre içine enjekte edilir. Bakteri yüzeyine adsorbe olan fajların nukleer materyali çeşitli şekillerde bakteri hücresi içine enjekte edilirler. Kasılalabilir kılıflı kuyruklu fajlarda kuyruk etrafındaki kılıf kasılarak kuyruk kısmının hücre duvarına girmesini sağlar. Bu sayede nukleik asitlerini sitoplazmaya enjekte ederler. Kapsid içindeki genetik materyal kuyruk içindeki kanaldan geçerek periplazmik boşluğa gelir ve buradan kısa süre sonra stoplazmaya geçer. Açılan delik bakteri tarafından hemen tamir edilir. Kapsid ve kuyruk dışarıda kalır, içeri giremez. Diğer fajlarda ise nukleik asit kısmı bakteri içerisine özel bir mekanizmayla, kapsit kısmı dışarıda kalacak şekilde girerler.

23 Adsorbsiyon ve Penetrasyon Mekanizmasının Şematik Görünümü

24 Bakteri İçinde Gelişme Dönemi
Bu dönem fajı oluşturacak çeşitli yapıtaşlarının sentezlendiği dönemdir. Bu dönemde baş, kuyruk ve diğer faj yapıları oluşur. Yani tam olarak faj yapısı meydana gelir. Latent dönem olarak da adlandırılan bu dönem fajların genetik materyallerinin bakteri sitoplazmasına girmesinden olgun fajların oluşumuna kadar geçen süreyi içine alır. Bu dönemde ilk önce faja ait yapıtaşları ayrı ayrı sentezlenir. Faja ait nükleik asit kısmı replike olur. Daha sonra ayrı ayrı sentezlenen bu yapı taşları bir araya gelerek olgun faj partiküllerini meydana getirir.

25 Bakteri İçerisinde Oluşan Fajların Serbest Hale Geçmesi
Bakteri içerisinde bol miktarda gelişen ve olgunlaşan fajlar belirli bir sayıya ulaştıktan sonra bakterilerden çıkarak serbest hale gelirler. Serbest hale geçen fajlar, yeni bakterileri enfekte ederek hayat sikluslarını devam ettirirler. Bakteriyofajların serbest hale gelmesi bakteriyofajların enfeksiyon tiplerine göre farklılık gösterir.

26 Faj Enfeksiyon Tipleri
Fajlar duyarlı bakterilerde genellikle 2 tür enfeksiyona neden olurlar. 1 – Litik enfeksiyon 2 – Nonlitik enfeksiyon Persistent enfeksiyon Lizojenik enfeksiyon

27 Litik Enfeksiyon Bu tür çoğalma sonucunda bakteri hücreleri genellikle parçalanarak erirler. Yani lizise uğrayarak ölürler. Litik enfeksiyonlarda konak bakterinin erimesi ve fajların serbest hale geçmesinde faj genomunda kodlanan spesifik litik enzimlerin önemli fonksiyonları vardır. Bu enzim sayesinde fajlar belirli bir sayıya ulaştıktan sonra hücre duvarını eriterek serbest hale gelirler. Her bir litik siklusta yaklaşık yeni faj oluşur.

28 Nonlitik enfeksiyon Nonlitik enfeksiyonlarda bakterilerde lizis meydana gelmez. Bu tür çoğalma sonucunda bakteri canlılığını kaybetmez. Yani bakteri içinde faj çoğalması bakterinin canlılığını ve çoğalmasını etkilemez. Bu yüzden bu tür fajlara bakterilerin yaşamlarını etkilemediği için temperate ya da ılımlı faj adı verilir. Olgun fajlar hücrede gelişimini tamamladıktan sonra hücre duvarından dışarı çıkarlar. Bakterilerde hiçbir değişiklik olmaz ve bakteriler normal yaşamlarına devam ederler. Nonlitik enfesiyonlar 2 şekilde oluşur 1 – Persisten Enfeksiyon 2 - Lizojenik Enfeksiyon

29 Persisten Enfesiyon Konak bakteri sitoplazmasında bulunan faj bağımsız replikasyona uğramaz. Bakterinin her bölünmesinde faj da replike olarak yavru bakteriye aktarılır. Bu şekilde faj bakteri içerisinden çıkmaksızın nesilden nesile aktarılarak canlılığını sürdürür. İçinde bulundukları bakterilere zararları bulunmaz

30 Lizojenik Enfesiyon Bazı fajlar bakteri içine girdikten sonra faj DNA’sı bakteri DNA’sı ile entegre hale gelir Bu şekilde DNA' sı ile bütünleşmiş faj taşıyan bakteriye lizojen bakteri adı verilir. Bu olaya lizojeni, bağlanan faja da profaj adı verilir. Lizojenik bakteriler de diğer bakteriler gibi çoğalırlar ve hayati fonksiyonlarını devam ettirirler. Böylece bir lizojenik bakteriden iki yavru lizojenik bakteri meydana gelir.

31 Bakteriyofaj Enfeksiyonunun Şematik Görünümü

32 Bakteriyofajların Bulundukları Yerler ve İzolasyonları
Bakteriyofajlara genellikle bakterilerin bulunduğu her yerde rastlanır Bu nedenle sindirim sisteminde, dışkıda, lağım sularında, derelerde, göllerde, gübreli topraklarda ve deniz sularında bolca rastlanır. Buralardan kolaylıkla izole edilebilirler. Diğer bir faj kaynağı ise profaj taşıyan lizojenik bakterilerdir. Faj izolasyonu için özellikle dışkı ve dışkı ihtiva eden sıvılar çok uygundur.

33 Dışkıdan Faj İzolasyonu
Dışkıdan bir miktar alınarak sıvı besiyerine ekilir ve homojenize edilir. Kültür sıvısı santrifüj edildikten sonra üst sıvı alınarak 0.2 um çapındaki filtrelerden süzülür. Bakteriler bu filtreyi geçemez, fajlar ise geçerler. Fajın varlığı katı besiyeri üzerinde üretilen çeşitli bakteri kültürleri üzerine süzülen bu sıvıdan damlatılarak tesbit edilir. Filtrat damlatılan yerlerde erime olması faj varlığını gösterir. Lizojenik fajların izolasyonunda ise daha özel teknikler vardır. Lizojenik faj araştırılacak sıvı genellikle UV ışınlarına maruz bırakıldıktan sonra bakteri kültürleri üzerine ekimleri yapılır. Erime plakları görülmesi faj varlığını gösterir.

34 Faj Üremesinin Gözlenmesi
Faj üremesinin gözlenmesi üremekte olan bakteri kültürleri üzerine faj içeren sıvıdan ekimler yapılarak olmaktadır. Bu da iki şekilde yapılabilmektedir. 1 – Sıvı besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi 2 – Katı besiyerinde faj üremesinin gözlenmesi

35 Sıvı besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi
Sıvı besiyerine önce bilinen bakteriden ekilir. 37 oC ' de 4-5 saat inkübe etmek suretiyle bakterinin bir miktar üremesi sağlanır. Hafif bir bulanıklık elde edildiğinde, bu bakteri kültürü üzerine, bakteriye özgül faj ihtiva eden solüsyondan belirli bir miktar ekilir ve karıştırılır. 37 o C' de 8-10 saat inkübe edilir. Bu süre sonunda faj üremesine bağlı olarak bakteriler lizise uğrarlar. Buna bağlı olarak da normalde bulanık olan kültürün görünümü berraklaşır.

36 Katı Besiyerinde Faj Üremesinin Gözlenmesi
Bu amaçla katı besiyeri üzerine tüm yüzeyi kaplayacak şekilde bilinen bakteri süspansiyonundan ekilir. 4 - 5 saat süreyle 37 0C' de inkübe edilir. Bu süre içinde ekilen bakteriler üremeye başlarlar. Daha sonra besiyeri üzerine belli bir miktar faj solüsyonundan damlatılır ve bütün yüzeye yayılır. 37 oC' de bir gece inkübe edilir. İnkübasyon sonunda faj ekilen bölgelerde, bakteri erimesine bağlı olarak yuvarlak plakların oluştuğu görülür. Bunlara faj plakları adı verilir. Her bir faj düştüğü alandaki bakterileri eriterek plak oluştururlar. Eğer çok sayıda faj düşmüşse, faj üremesine bağlı olarak tüm alanlarda bakteri erimesi gözlenir. Bu durumda faj plakları gözlenemez. Faj plakları mm büyüklüğünde olabileceği gibi, gözle zor görülecek kadar küçük de olabilirler.

37 Bakteriyofajların Sayılması
Tek tek düşmelerini sağlamak amacıyla faj süspansiyonu sulandırılarak, duyarlı bakteri bulunan katı besiyerlerine ekilir. Uygun inkübasyondan sonra oluşan faj plakları sayılır. Daha sonra ekilen miktar ve fajın sulandırım oranlarından faydalanılarak faj ihtiva eden süspansiyonun mm3' deki faj sayıları hesaplanabilir.

38 Bakteriyofajların Kullanım Yerleri
Bakteriyofajlar en yaygın olarak bakterilerin tip tayininde kullanılır. Bu ise epidemiyolojik araştırmalarda önemlidir. Bakteriyofajlar ancak belirli tür bakterilere ve bu türler içindeki belirli suşlara etki ederler. Bu şekilde eldeki bilinen fajları mevcut bakterilerle deneyerek, bakterileri tiplendirmek mümkündür. Antibiyotikler geliştirilmeden önce Salmonella, Shigella, E coli, Vibrio cholera ve Stafilokok enfeksiyonlarında fajlar tedavi maksadıyla kullanılmakta idi. Antibiyotiklerin kullanıma girmesiyle artık bu tedavi yöntemi kullanımdan kalkmıştır. Günümüzde fajlardan genellikle rekombinant DNA teknolojisinde yararlanılmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinde genellikle fajlar aracı(vektör) bir molekül olarak kullanılmaktadır. Bazı önemli genetik bilgiler fajlara entegre edilerek duyarlı bakteriye verilirler. Bu sayede bakterilere istenilen genlerin ekspresyonu sağlanmış olur.