SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

... konulu sunumlar: "SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ"— Sunum transkripti:

1 SEROLOJİK TANI YÖNTEMLERİ
Yrd. Doç. Dr. İbrahim Halil KILIÇ

2 Seroloji, serum imali veya tesirlerini konu alan bilim dalıdır
Seroloji, serum imali veya tesirlerini konu alan bilim dalıdır. Serolojik testler, in-vitro antijen-antikor birleşmesi mekanizmasına dayanan immünolojik temelli yöntemler olduğundan bu testlerde temel amaç, bilinmeyen bir reaktifi bilinen bir reaktif kullanarak saptamaktır. Serolojik deneyler niceliksel temele dayalı olarak yapılır. Yani ortamda bulunan antijen ya da antikorun yalnızca bulunup bulunmadığı değil, aynı zamanda ne kadar bulunduğu da önemlidir. Serolojide kan, semen, tükürük, idrar, gözyaşı ve göz içi sıvısı, gaita, mide özsuyu, lenf sıvısı ve diğer tüm vücut sıvıları incelenir.

3 Günümüzde serolojik yöntemler viral, bakteriyel, fungal ve parazit enfeksiyonlarının tanısı amacıyla kullanılmalarının yanı sıra; immünizasyon, immün rekonstitüsyon ve immün süpresyon sonrası immün kompetansın değerlendirilmesi, immün sistem yetmezliklerinin ya da hiperaktivitesinin belirlenmesi, malignansilerin tanısı, transplantasyon öncesi MHC tespiti ve immünolojik hastalıkların tedavi ve progresyonunun izlenmesi gibi alanlarda büyük değere sahiptirler. Serolojik tanı için, mekanizmalarına (aglütinasyon, presipitasyon), uygulama şekline (otomatize, manuel), hızlarına (birkaç saatten birkaç güne kadar) ve kullanım amaçlarına göre (antikor tipi tesbiti, kantitasyon, vb.) çok sayıda yöntem mevcuttur.

4 Mikrobiyoloji ve enfeksiyon hastalıkları çerçevesinde serolojik tanı iki amaca yönelik olarak uygulanabilirler: 1)Enfeksiyon hastalıklarının tanısında serolojik testler a)Elimizdeki bilinen mikroorganizma antijenlerini kullanarak insan serumlarında (ya da diğer vücut sıvılarında) bunlara karşı antikorların bulunup bulunmadığının ve varsa miktarının araştırılması ile hastalığın tanısı konusunda araştırma yapmak, b)Hastalardan alınan inceleme örneklerinde hastalık örneklerine ait antijenlerin serolojik deneylerle ortaya konulması. Bu şekilde elde bulunan ve niteliği bizce bilinen antikorlar (bağışık serumlar) kullanılarak hastalık inceleme örneklerinde mikroorgnizmalara ait antijenlerin ortaya konulması. 2)Elimizdeki bilinen antikorları içeren bağışık serumları kullanarak mikroorganizmaların antijen yapısını incelemek, bu yapıyı ortaya koyarak mikroorganizmaları tanımak.

5 Serolojik yöntemlerin klinik mikrobiyolojide kullanım alanları şu şekilde sıralanabilir:
Enfeksiyon hastalıklarının laboratuvar tanısı Hasta serumunda özgül antikor varlığının gösterilmesi ve titrasyonu Klinik örneklerde etken mikroorganizma antijenlerinin belirlenmesi Kültürde izole edilen mikroorganizmaların tanımlanması ve tiplendirilmesi

6 Serolojik yöntemlerin klinik mikrobiyolojide
kullanım alanları şu şekilde sıralanabilir: Enfeksiyonların tedaviye yanıtının izlenmesi Konjenital ya da yeni doğan enfeksiyonlarının tanısı ve izlemi İmmün durumun belirlenmesi; geçirilmiş enfeksiyonların ya da immünizasyonların değerlendirilmesi Populasyon taramaları ile toplumlarda enfeksiyonların epidemiyolojisi hakkında veri sağlanması

7 Antijen-antikor birleşmesi şu özelliklere sahiptir:
Antijen-antikor birleşmesi özgül olduğu için elde ikisinden birisi olduğu zaman onu ayıraç olarak kullanıp diğerini araştırmak, tanımak ve elde etmek mümkündür. Antijenlerin, kendi antikorlarına karşı özgüllüğünü belirleyen özel kimyasal gruplardır. Yani antijendeki spesifik determinant grupları ile (epitoplar), antikorlarda Y’nin kollarının uç kısımlarında yani aminoterminal uçlarda, V bölgesinde bulunan belirli bir grup aminoasitlerin oluşturduğu, antikorun birleşme yanı (paratoplar) arasında gerçekleşir.

8 Antijen-antikor birleşmesi şu özelliklere sahiptir:
Antijen yapısındaki maddelerde çoğu kez birden çok belirtici grup bulunduğundan bunlar birden çok antikor molekülünü bağlama yeteneğindedirler. Bir antijen molekülündeki belirtici grupların hepsi aynı kimyasal yapıda olabildikleri gibi değişik kimyasal yapıda da olabilirler. Bu durumda aynı antijen molekülüne değişik yapı ve özellikteki antikorlar bağlanabilirler. Antijen-antikor birleşmesi iki basamakta oluşur.

9

10

11 AGLUTİNASYON VE HEMAGLÜTİNASYON TESTLERİ

12 Aglütinasyon: Süspansiyon halindeki bakterilerin, eritrosit, lökosit gibi hücrelerin yüzeylerinde doğal olarak bulunan ya da eritrositlerin, lateks, bentonit gibi entetin parçacıkların yüzeylerine yapay olarak yapıştırılmış antijenler, elektrolitli ortamda kendi antikorları ile birleşecek olurlarsa hücre veya parçacıklar birbirlerine yapışarak gözle görülebilecek büyüklükteki kümeler halinde çökerler. Bu olaya aglütinasyon adı verilir. Aglütinasyon reaksiyonu, partikül halindeki antijenlerin özgül antikorlarla birleşmesi ve çapraz bağlar oluşturarak kümeleşmesi esasına dayanır. Partiküler antijen olarak, bakteri hücresinin ya da eritrositlerin kendisi veya taşıyıcı partiküller kullanılır. Ertirositlerin kullanıldığı yöntemler ‘hemaglütinasyon’ olarak adlandırılır. Reaksiyon sonucu oluşan antijen-antikor kompleksleri küçük kümeler şeklinde gözlenir.

13 Aglütinasyon testleri, hazır antiserumlar kullanılarak klinik örnekte antijen tayini, kültürde üretilmiş bir bakterinin tiplendirilmesi ya da bilinen antijenler kullanılarak serumda antikor tayini ve kantitasyonu amacıyla yaygın olarak kullanılır. Aglütinasyon olayının olabilmesi için antijeni taşıyan hücre ya da diğer parçacıkların elektrolitli ortamda (örneğin: fizyolojik tuzlu suda) asıntı (süspansiyon) halinde olmaları gereklidir. Böyle bir ortamdaki çok küçük parçacıklar (-) elektrik yüklü olduklarından birbirlerini iterek asıntı durumunda bulunurlar (elektrostatik itme gücü).

14

15 Aglütinasyon ile serolojik tanının şu amaçları vardır:
Hasta serumlarında, mikroorganizma antijenlerine karşı antikorlar araştırılarak hastalık tanısı koymak, Bilinen antikorlarla kaplanmış eritrosit, stafilokok A proteini ve sentetik parçacıkların kullanılmasıyla hastalık materyalinde mikroorganizma antijenlerinin araştırılması ile hastalık tanısı koymak, Eritrositlerin bazı antijenlerine karşı oluşmuş antikorları araştırarak bazı hastalıkların tanısını koymak, Kan gruplarını araştırmak.

16

17 Tüm Bakteri Aglütinasyonu: Bu yöntemde tüm bakteri hücreleri partikül olarak kullanılır ve antikorlar araştırılır. Kullanılan bakteriler kültürde üretilmiş ve kimyasal yollarla öldürülmüştür. Genellikle tüplerde gerçekleştirilir. Hasta serumu dilüsyonları yapılarak üzerine standart miktarda bakteri süspansiyonu eklenir ve 1 gece etüvde inkübe edilir. Değerlendirmede, tüplerin çalkalanmasıyla süspansiyon içinde oluşan partiküllerin varlığı dikkate alınır. Aglitünasyonun görüldüğü en son serum sulandırımı serumun titresi olarak kabul edilir. Pratikte en yaygın olarak Brucella ve Salmonella enfeksiyonlarında antikor tayini için kullanılmaktadır.

18 Lateks Aglütinasyonu (LA): Bu yöntemde partiküler antijen olarak lateks boncuklar kullanılır ve lam veya özel karteksler üzerinde gerçekleştirilir. Lateks yüzeyi, antijen araştırılacaksa antikor molekülleri ile, antikor araştırılacaksa antijen molekülleri ile kaplıdır. Pozitif reaksiyonun değerlendirilmesi kümeleşmenin şiddetine göre +1 ile +4 arasında derecelendirilir. LA testi ile alınan sonuçlar kullanılan lateks partikülünün boyutuna, kullanılan antikorların avidite ve affinitesine (monoklonal veya poliklonal), ısı, pH, iyon konsantrasyonu ve örnekteki antijen konsantrasyonu gibi değişkenlere bağlıdır. Dolayısıyla her çalışmada mutlaka pozitif ve negatif kontrol kullanılmalıdır.

19 Koaglütinasyon (CoA): Bu yöntemde partikül olarak öldürülmüş S
Koaglütinasyon (CoA): Bu yöntemde partikül olarak öldürülmüş S. aureus bakterisi kullanılır. Bu bakterinin hücre duvarında bulunan ‘protein A’ maddesi büyük miktarda antikor bağlama özelliği taşır. Stafilokokların yüzeyine istenilen özgüllükte antikor molekülü –Fab (antijen bağlama) bölgeleri serbest olacak şekilde –Fc kısmından bağlanır ve LA testinin aksine bu yöntem sadece antijen tespitinde kullanılabilir. Özgüllüğü yüksek olmasına rağmen duyarlılığı LA testine göre düşük olduğundan örnekten direk antijen tespitinde önerilmez.

20 Direkt Hemaglütinasyon: Bu yöntem, bazı enfeksiyonlarda eritrosit yüzeyindeki antijenlere karşı doğal olarak oluşan antikorların tespitinde kullanılır. Örneğin Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunda insan eritrositlerini soğukta (4C’de) aglütine eden ‘soğuk aglütininler’ ve EBV akut enfeksiyöz mononükleozis’inde koyun eritrositlerini aglütine eden hetearofil antikorlar (Paul – Bunnel testi ) gibi. Bu testler hızlı tanı için yararlı olmalarına rağmen özgüllük ve duyarlılıkları düşüktür.

21

22 İndirek (pasif) Hemaglütinasyon (İHA): Bu yöntem antikor saptanmasında kullanılır ve 96 çukurlu ‘U’ tabanlı mikropleytlerde gerçekleştirilir. Çeşitli antijenler (bakteriyel, viral, fungal, paraziter), kimyasal maddeler kullanılarak (örn:tannik asit) eritrosit (genellikle koyun eritrositi) yüzeyine bağlanmıştır (duyarlılaştırma). Hasta serumu dilüsyonları üzerine duyarlılaştırılmış eritrositler eklenir. Pozitiflik olduğunda hemaglütinasyon, negatiflik varsa düğme gibi çökme görülür. Testte hasta serumu kontrolü ve eritrosit kontrolü kullanılmalı ve bunlarda çökme olduğunda değerlendirme yapılmalıdır. Hasta serumu kontrolünde hemaglünitasyon olması; serumda koyun eritrositlerine karşı heterofil antikor varlığını gösterir. Bu durumda hasta serumu, adsorban (konsantre koyun eritrosit süspansiyonu) ile muamele edilir, santrifüj ile heterofil antikorlar uzaklaştırılır ve test tekrar çalışılır. Bu yöntem laboratuvarda sifiliz serolojisinde (TPHA testi ) ve amip ve ekinokok antikorlarının araştırılmasında kullanılmaktadır.

23

24

25

26 PRESİPİTASYON İLE PRESİPİTASYON İLE SEROLOJİK YÖNTEMLER

27 PRESİPİTASYON… Suda erimiş durumda bulunan antijenlerin, elektrolitli ortamda kendilerine özgü immünoglobülinler (antikorlar) ile birleşmeleri sonucunda önce bulanıklık sonra ince granüllü bir çökme ile sonuçlanan olaya presipitasyon denir. Presipitasyondan hem enfeksiyon hastalıklarında tanı koymak hem de mikroorganizmaların identifikasyonu amacıyla yararlanılır.

28 Presipitasyon ile serolojik tanı yöntemlerini şu gruplara ayırabiliriz:
Halkalı presipitasyon deneyi Immünodifüzyon yöntemleri Elektro-İmmüno difüzyon tekniğine bağlı presipitasyonlar Türbidimetrik ve nefelometrik yöntemler

29 A) HALKALI PRESİPİTASYON DENEYİ
Bir sıvıda belirli bir antikora özgül antijenin bulunup bulunmadığı veya besin maddelerinde bulunan yabancı proteinlerin, kuşkulu lekelerin insan ya da hayvan kanı olup olmadığının anlaşılmasında kullanılabilir. İnce bir tüpte uygun antijen ve antikor içeren sıvıların, birbirlerine karışmayacak ve üst üste bir tabaka oluşturacak biçimde konulmaları sonucunda, iki sıvının birleşme yerinde bulanık bir halkanın oluşması temeline dayanır.

30

31 Halkalı presipitasyon deneyine örnek verecek olursak;
→ Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus pneumoniae menenjitlerinde, bu mikroorganizmalara karşı elde edilmiş bağışık tavşan serumları ile beyin omurilik sıvısının karşılaştırılması sonucunda oluşabilen presipitasyon halkasına bakarak tanı konulabilir. Halkalı presipitasyon yöntemi streptokok ve pnömokokların tiplendirilmelerinde de kullanılabilir.

32 B) İMMÜNODİFÜZYON YÖNTEMLERİ
Bu yöntemler, antijen ve antikorun agaroz jel ortamında difüze olarak karşılaşması ve uygun oranlarda karşılaştıkları bölgede bulanık presipitasyon çizgileri, bandları oluşturmalarına dayanır. İmmünodifüzyon yöntemi Çift yönlü difüzyon (ouchterlony) Tek yönlü difüzyon (mancini)

33 ÇİFT YÖNLÜ DİFÜZYON (OUCHTERLONY)
Jel içinde çukurlar açılır, ortadakine bilinen antiserum, kenardakilere ise antijen aranan hasta serumu dilusyonları (ya da tam tersi) damlatılır. Etüvde bir gece inkübe edilir ve presipitasyon bantları değerlendirilir. Bu yöntemde hem antijen hem de antikor molekülleri jel içinde yayılarak (özgüllük varsa) optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon bandı oluştururlar. Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz antijenlerinin belirlenmesinde kullanılır.

34

35 TEK YÖNLÜ DİFÜZYON (MANCİNİ)
Bu yöntemde antikor jel içine eklenmiştir. Jelde açılan çukurlara araştırılacak antijeni içeren serum damlatılır. Etüvde bir gece inkübasyondan sonra presipitasyon zonları değerlendirilir. Burada sadece antijenler yayılır ve jel içinde bulunan antikor ile optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon halkası oluşturur. Oluşan halkanın çapı antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

36 mancini ouchterlony Ag Ab in gel Ag Concentration Diameter2

37 C) ELEKTRO- İMMÜNODİFÜZYON YÖNTEMLERİ
Bu yöntemlerde antijen ve antikor moleküllerinin agaroz jeldeki hareketleri elektrik akımı kullanılarak kolaylaştırılmış ve hızlandırılmıştır. Birçok bakteriyel antijen negatif yüklüdür, buna karşın antikor molekülleri nötral özelliktedir. Dolayısıyla hafif alkalen buffer içeren agaroz içinde antijenler anoda, antikorlar ise buffer akımıyla katoda doğru göç ederler. Moleküllerin uygun oranlarda karşılaştıkları bölgelerde presipitin bantları veya arkları oluşur. Bu yöntemlerin duyarlılıkları aglütinasyon testlerine göre düşük, uygulamaları zahmetli ve pahalıdır.

38

39 Elektroimmüno difüzyon tekniğinin 2 çeşidinden bahsedilebilir:
Basit, tek yönlü immünodifüzyon (Laurell tekniği) : Roket elektroforezi de denilen bu yöntemde daha çok titresi bilinmeyen bir antijenin titresini, titresi bilinen aynı türdeki bir antijen ile karşılaştırarak ölçmek amaçlanır. Karşıt immünoelektroforez (counter immuno electrophoresis = CIE) : Ag. ve Ak. elektrik akımı ile zıt yönlere göç eder. Ag. ve Ak. zıt yüklere sahip olduğunda kullanılır.

40 İnsan serumunda hepatit B yüzeysel antijeni, beyin-omurilik suyunda N
İnsan serumunda hepatit B yüzeysel antijeni, beyin-omurilik suyunda N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, Cryptpcoccus neoformans ve B grubu streptokok antijenlerinin araştırılmasında kullanılmaktadır. Ag Ab - +

41 LAURELL TEKNİĞİ

42 D) TÜRBİDİMETRİK ve NEFELOMETRİK YÖNTEMLER
Bu yöntemler, sıvı ortam içinde karşılaştırılan ve birleşerek bulanıklık oluşturan antikor- antijen komplekslerinin içinden geçen ışık şiddetine göre kantitatif olarak ölçüldüğü otomatize yöntemlerdir. 3 tiptir: → Transmissive sensörler → Scatter sensörler → Oran sensörleri

43 1- Transmissive Sensörler; bir ışık kaynağı ve ışığın şiddetine duyarlı bir sensörden oluşur. Sensör ışığı direkt olarak görecek şekildedir. İncelenecek örnek ışık kaynağı ve sensör arasına konur. Bulanıklık arttıkça sensörün çıkış sinyali monoton azalma gösterir. Bunlar yüksek bulanıklık düzeylerinde ölçüm yapmak için kullanılır, düşük bulanıklık düzeylerine duyarlılıkları azdır. 2- Scatter Sensörler; bir ışık kaynağı ve ışığın şiddetine belirli bir açıyla yerleştirilmiş fotoelektrik sensör bulunur. Fotoelektrik sensör ışık kaynağını direkt olarak görmez, örneğin içinden geçen ışın demetinden saçılan ışığı ölçer. Bulanıklık arttıkça fotoelektrik sensörün sinyal düzeyinde monoton artış gözlenir. Bu tip sensörlerin düşük bulanıklık düzeylerine duyarlılık yüksektir. 3- Oran Sensörleri: en iyi performansa sahip olan tiptir. Bir ışık kaynağı, bir transmassive ve bir de scattering sensörden oluşur. Örneğin bulanıklığına bağlı olarak artış gösteren çıkış sinyali, her iki sensörün sinyallerinin oranlanmasıyla elde edilir. Bu sistemler daha fazla elektriksel ve optik bileşen içerdiklerinden maliyeti daha fazladır.

44

45 NÖTRALİZASYON ve FLOKÜLASYON TESTİ

46 Nötralizasyon yöntemi
Vücuda giren infeksiyöz ajanlarına karşı oluşan ve bunların infektivitesini veya infeksiyon yapma yeteneğini ortadan kaldıran antikorlar meydana gelir ki bu antikorlara nötralizasyon antikorları adı verilir ve böyle olguya nötralizasyon adı verilir. Test sadece viruslara özgü olmayıp toksin ve enzimler için de uygulanabilir. Nötralizan antikorların ortaya konmasında hücre kültürleri ve embriyolu yumurtalardan fazlaca yararlanılır. Hücrelerde CPE yapan veya embriyolu yumurtalarda ölümler oluşturan viruslar, kendine karşı oluşmuş antiviral antikorla oda ısısında dk. tutulduktan sonra, canlı sistemlere ekildiğinde hücrelerde CPE'ler ve embriyolarda ölümler görülmez (nötralizasyon pozitif) veya bu olgularda, antikorun miktarına göre değişik derecede azalmalar görülür.

47 Virüslere karşı nötralizan antikorların saptanmasında canlı hücre sistemleri kullanılır.
Yöntemde antikor varlığı araştırılacak olan hasta serumu sulandırılır ve her bir sulandırım standart miktarda karıştırılarak pleyt çukurlarında hazırlanmış tek tabakalı hücre kültürlerine inoküle edilir. Serumda nötralizan antikor varlığında virüs reseptörleri bloke edeceğinden hücre kültürlerinde sitopatik etki (CPE) ortaya çıkmaz.

48

49 Aşağıdaki örnekte CPE oluşumu 4 nolu çukurda tamamen önlenmişken 5 nolu çukurda CPE pozitifliği %50 dir. CPE nin önlendiği en yüksek hasta serumu sulandırımı, o serumun titresini verir.

50 Deney yapılmadan önce virüsü titre etmek gerekir
Deney yapılmadan önce virüsü titre etmek gerekir. %50 son noktalar Reed Muench metoduna göre hesaplanır. İnokulasyon yapılan hayvan veya yumurta veya doku kültürünün %50sini infekte eden virüs miktarı ID 50 Hayvanların %50sini öldüren virüs miktarı LD 50 , Hayvanların %50 sinde paralizi meydana getiren virüs miktarı PD 50 , Ekim yapılan doku kültürlerinin %50 sinde CPE oluşturan virüs miktarı ise TCID 50 ile gösterilir.

51 Hesaplamada Reed ve Muench yöntemi kullanılır.
LD50 titresinin = %50 ölüm oranının üstündeki ilk Nisbi uzaklık negatif logaritması sulandırımın neg logaritması Örneğin kuduz virüsünün LD 50 titresini hesaplamaya çalışırsak; Hesaplamada Reed ve Muench yöntemi kullanılır. Bu amaçla virüslerin 10-1,10-2, şeklinde sulandırımları yapılır. Her dilüsyondan 10 fareye beyin içi yolla 0,03 ml virüs inoküle edilir ve 14 gün süreyle gözlenir. İlk 3 gün içerisinde ölenler nonspesifik ölümlerdir. 4. günden itibaren ölen ve paralizi olan fareler not edilir. 14 günün sonunda bir cetvel hazırlanır ve burada her dilüsyon için toplam ölü ve canlı kalanlar hesaplanarak yüzde oranlı (%) kaydedilir .

52 Bunlar kaydedildikten sonra aşağıdaki formüle göre LD 50 hesaplanır.
Toplam ölümler hesaplanırken ölü sayıları aşağıdan yukarıya, canlı sayıları yukarıdan aşağıya toplanır. Burada izlenen yol: 10-5,sulandırımda ölen 10-4, te de nasıl olsa ölür , 10-2 de canlı kalan 10-3 te de nasıl olsa canlı kalır düşüncesidir. Bunlar kaydedildikten sonra aşağıdaki formüle göre LD 50 hesaplanır. LD 50 = %50nin üstündeki ölüm /%50nin üstündeki ölüm-%50nin altındaki ölüm Bulunan sayı % 50'nin hemen üzerinde ölüm gösteren virüs süspansiyonunun sulandırım oranına eklenir. Bu durumda % 50' nin üzerinde ölüm olan virüs sulandırımı 10-3 olduğu için,10(-3)+(-0,5) = 10-3,5. Yani bu durumda LD 50 = 10-3,5 dir.

53 LD 50 nin hesaplanması 10-1 10 30 30/30 100 10-2 9 1 20 20/21 95 10-3
Virüs sulandırımı İnoküle edilen hayvan Ölü Canlı Toplam Ölü Toplam Canlı Toplam Oranı % oranı 10-1 10 30 30/30 100 10-2 9 1 20 20/21 95 10-3 6 4 11 5 11/16 70 10-4 5/16 32 10-5 1/21

54 Deney hayvanlarında nötralizasyon testi
Deney hayvanı olarak genellikle fareler kullanılır. Örneğin bir kuduz aşısı ile aşılanmış şahıslarda oluşan nötralizan antikorların araştırılması için farelerde yapılan nötralizasyon testine kısaca değinecek olursak, aşılı kimselerden alınan serum steril tuzlu su ile ¼ oranında sulandırılır. Üzerine daha önce %50 ölüm dozu tespit edilmiş sabit virüsün 200 LD 50 dozunu bulunduran virüs sulandırımından aynı miktar ilave edilerek karışım bir saat 37˚C de inkübe edilir.

55 Her serum -virüs karışımı ortalama 12 gr ağırlığındaki 4-5 haftalık 10 fareye beyin içi yolla 0,03ml olarak inoküle edilir. İnokülasyon esnasında farelerin bayıltılması gerekir. Farelerin gözlemi 4. günden itibaren başlar ve hergün düzenli olarak kaydedilir. İkinci hafta sonunda elde edilen bulgulara göre serumlarda bulunan antikor tespit edilir. Ters kantitatif olarakta yapılabilir. Burada 8-10 farenin canlı kalması serumda antikor bulunduğunu gösterir.

56 Doku kültürlerinde nötralizasyon testi
Nötralizasyon testi bugün daha ziyade doku kültürlerinde yapılmaktadır. Buradaki prensip spesifik virüs antikorlarının virüsün yapacağı CPE yi nötralize etmesidir. Testte çift serum ile çalışılır ve üzerlerine eşit miktarda virüs sulandırımı ilave edilip oda ısısında 1 saat bırakılır. Sonra bu serum-virüs karışımlarının her bir dilüsyonundan 2-4 kültür tüpüne 0.1 er ml inoküle edilir. İnokülasyon yapılan tüpler etüve konur ve hergün kontrol edilerek CPE meydana gelip gelmediği araştırılır. Her deneyde negatif ve pozitif kontrol serumları ile doku kültürü kontrolleride kullanılmalıdır. Negatif serum-virüs karışımı inoküle edilen tüpte CPE nin görülmesiyle test sona ermiş olur. CPE nin görülmediği en yüksek serum sulandırımı nötralizasyon titresi olarak kabul edilir.

57

58

59 Embriyonlu yumurtada nötralizasyon deneyleri:
Embriyonlu yumurtada nötralizasyon deneyi influenza, kabakulak, çiçek ve herpervirüsleri ile yapılır. İnfluenza ve kabakulak virüsü ile yapılan nötralizasyon testi allantoik keseye inokülasyonla yapılır ve hemaglütinasyon testi ile kontrol edilir. Çiçek ve herpes virüsleri ile nötralizasyon testi koryoallantoik zara inokülasyonla ve kontroluda burada oluşan poksların sayımıyla yapılır.

60

61 Metabolik inhibisyon testi
Bu testde bir cins nötralizasyon testidir. Bu teste de virüs-serum karışımı oda ısısında 1 saat tutulduktan sonra genellikle mikrotitrasyon plağında bilinen miktardaki hücre süspansiyonlarına ilave edilir. Eğer virüs serum tarafından nötralize edilmişse bu godelerdeki hücreler kontrol godelerdeki gibi üremelerine devam edeceklerdir ve meydana gelen metabolizma ürünleri ortamı asit yapacağından besiyerinin rengi değişecektir. Besiyerinde indikatör olarak fenol kırmızısı bulunduğundan,bu indikatör asit ortamda sarı renk alır ve besiyeri sarı renkte görülür.

62 Virüs, serum tarafından nötralize edilmemişse hücrelerde nekroz yapacağından hücreler ölür, metabolizma ürünleri oluşmaz ve ortam değişmeyeceğinden besiyeri kırmızı renkte kalır (pH da fenol kırmızısı kırmızı renktedir). Bu sebeple mikroskopla muayeneye gerek kalmadan plaktaki renklere bakılarak karar verilir.

63 FLOKULASYON Kahn testi, sifiliz hastalığının aranmasın­da kullanılan wasserman ve VDRL (Venergl Diseases Research Laboratories test) gibi bir laboratuvar testidir. İlk defa Reuben Leon Kahn tarafından kullanılan en önemli flokulasyon testlerinden biridir. Bu testlerde hasta olup olmadığı araştırılacak olan kimsenin kan serumu, sifilize göre özel şekilde hazırlanmış organ ekstreleri ile karıştırılmakta ve flokulasyon yani bir çeşit çökelti meydana gelip gelmediği araştırılmaktadır. Kahn testinde bu esasa göre hazırlanmış Kahn antijeni kullanılır. Kahn antijeni ile karıştırılan hasta serumunda dakika sonra yumak şeklinde bir çökelme yani flokulasyon meydana gelirse sifiliz hastalığı var demektir.

64

65

66 İŞARETLİ KATI FAZ YÖNTEMLERİ ELİSA

67 İŞARETLİ KATI FAZ YÖNTEMLERİ
Tek bir serum örneğinde istenilen antikor tipinin (IgG, IgM, IgA, total) veya hasta örneğinde bulunan antijenlerin kısa zamanda saptanmasını sağlar.

68 Üzerine serum/örnek eklenir İşaretli konjugat (antikor) bağlanması
Antijen veya antikor katı ortamda hareketsiz Üzerine serum/örnek eklenir İşaretli konjugat (antikor) bağlanması Enzim  ELISA Radyoaktif madde  RIA (Radioimmuno assay) Floresanlı boya  IFA (İmmünofloresans yöntemi) Biolüminesan madde  Kemilüminesans Birleşmenin ölçümü

69 Mekanizma: reaktiflerden birisinin (antijen veya antikor) katı bir faza bağlanarak hareketsizleştirilmesi ve daha sonra özgül birleşmenin işaretli bir reaktif kullanılarak gösterilmesidir. İşaretli reaktifler genellikle insan Ig’lerine karşı hayvanda hazırlanmış ve işaretlenmiş anti-insan IgG, IgM molekülleri ya da araştırılacak olan antijene özgül işaretli antikor molekülleridir.

70 Y Y Klinik Örnekte Antijen Tespiti İşaretli İşaretli özgül Anti-insan
Hasta Serumunda Antikor Tespiti Katı Faz Y Ag Katı faza bağlı ag Hasta serumunda IgG İşaretli Anti-insan Katı Faz Y Ag Katı faza bağlı ak Klinik örnekte ag İşaretli özgül IgG

71 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Ag-Ak reaksiyon sonucu katı faza bağlanan enzim işaretli reaktiflerden yararlanılır. Değerlendirmeler; enzim ile substratının oluşturacakları renk reaksiyonuna göre yapilir. Beliren renkli reaksiyon ürünlerinin miktarı enzim işaretli reaktiflerin ve dolayısıyla katı faza bağlanan Ag ve Ak’un miktarını belirler EIA (enzyme immunoassay)

72 Avantajları Geniş enfeksiyon tanı parametreleri ticari olarak kolayca temin edilebilir, Yöntem otomasyona uyarlanabilir ve bu sayede çok sayıda örnek kısa sürede çalışılır, Sonuçlar kalitatif ya da kantitatif olarak değerlendirilebilir.

73 Özgül bağlanma Ag.ile kaplı çukur Hasta serumu Enzim işaretli konjugat Enzime özgül substrat Renk değişimi

74 Spektrofotometrik değerlendirme

75 Yarışmasız (non-competitive) Yöntem
Ag’e özgül antikorlar çukurlara bağlıdır. Örnek çukurlara eklenir. Ag varsa özgül olarak antikorla birleşir. İnkübasyon ve 3 kez yıkama yapılır. Ag’e özgül ve enzimle işaretli antikor eklenir. Yıkamadan sonra substrat eklenir. Durdurma solüsyonu eklenir. Reaksiyon durdurulur. Spektrofotometre – Absorbans değeri Direk / İndirek

76 Çukura bağlı özgül IgG

77

78 Varsa örnekteki Ag’nin IgG’ye bağlanması

79

80 İşaretli anti-IgG antikoru

81 Ag’e özgül işaretli IgG

82

83 Substrat ilavesi

84 Renk değişimi

85 Çukura bağlı özgül Ag

86

87 Varsa örnekteki IgG’nin Ag’e bağlanması

88

89 Ag’e özgül işaretsiz IgG

90 İşaretli anti-IgG antikoru

91

92

93 Substrat ilavesi

94 Renk değişimi

95 Yarışmalı (competitive) Yöntem
Mikropleyt çukurlarına özgül antikor bağlıdır. Örnek ile aynı anda enzimle işaretli Ag eklenir. Örnekteki Ag’ler ile işaretli Ag’ler antikora bağlanmak için kompetisyona girerler. İnkübasyon ve yıkamadan sonra substrat eklenir. Meydana gelen renk değişikliği hasta örneğindeki Ag miktarı ile ters orantılıdır. Ne kadar az Ag varsa antikorla birleşen işaretli Ag miktarı o kadar fazla olacaktır. Spektrofotometre

96 IgM Yakalama (Capture) Yöntemi
Özellikle etkene özgül IgM antikorlarının araştırılmasında yalancı pozitiflik ve negatiflikleri ortadan kaldırmak amacıyla uygulanır. Anti-insan IgM antikorları bağlanmış çukurlara serum eklenir ve inkübe edilir. Tüm IgM’ler yakalanır. Yıkamadan sonra çukurlara özgül Ag eklenir. Ag yakalanmış ve hareketsizleştirilmiş IgM’lerden özgül olanlara bağlanır. Yıkama yapılır ve Ag’e özgül enzimle işaretli IgG eklenir. İnkübasyon ve yıkamadan sonra substrat eklenir. Renk değişikliği IgM miktarı ile doğru orantılıdır. Spektrofotometre

97 Sonuçların değerlendirilmesi
Kalitatif Sonuç Cut-off değerine göre pozitif / negatif olarak değerlendirilir Genelde Ag, bazen IgM varlığının belirlenmesinde değerlidir. IgG düzeyi ve takibinde işe yaramazlar. Semi-Kantitatif Sonuç Serum OD / cut-off OD Antikor konsantrasyonunun ölçülmesinde değersizdir, antikor düzeyinin takibinde kullanılır. Kantitatif Sonuç Konsantrasyonu bilinen “standart serum” kullanılır. Standart serum sayısı ne kadar fazlaysa ölçüm aralığı o kadar geniş olur.

98 KOMPLEMAN BİRLEŞMESİ DENEYİ

99 Kompleman Bİrleşmesİ Testİ
Bu test, hasta serumunda etkene özgül antikor titrelerinin belirlenmesinde, özgül antijen-antikor birleşmesi sonucu komplemanın aktive edilmesi esasına dayanan klasik bir yöntemdir. Öncelikle hasta serumları 56°C’de 30 dk tutularak insan komplemanı ortadan kaldırılır. Daha sonra hasta serumlarının seri sulandırımları hazırlanarak üzerine önce bilinen antijen ve sonra da kompleman (1 günlük erkek kobay serumu) eklenir.

100 Kompleman Bİrleşmesİ Testİ
Bir gece 4°C’de bekletilir. Bu sürede hasta serumunda özgül antikor varsa ve kompleks komplemanı bağlayacaktır. Ertesi gün tüm çukurlara indikatör olarak hazır antijen antikor kompleksi yani hemolitik sistem eklenir. Hasta serumunda özgül antikor varlığında kompleman fikse edilmiş olduğundan hemolitik sistem üzerine bir etkide bulunmaz, buna karşın özgül antikor yoksa kompleman serbest olduğundan hemolitik sisteme etki ederek eritrositleri parçalar.

101 Kompleman Bİrleşmesİ Testİ
Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir Test birbirinden farklı üç komponent içerir  Test sistemi  Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)  Antijen (bilinen)  KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum)  İndikatör sistemi (hemolitik sistem)  Koyun eritrositleri  Koyun eritrositlerine karşı Ab

102

103

104

105

106

107

108 DEĞERLENDİRME; Hasta serumunda Ab varsa
 Ag ve Ab birleşecek (klasik yol)  C, Ag ve Ab’ye bağlanacak  Ortamda C kalmayacağı için  Hemolitik sisteme bağlanamayacak  Hemoliz olmayacak  Bazı viral, riketsiyal ve fungal hastalıkların tanısında  1990’lı yıllarda Sifiliz için KOLMER Kompleman komponentlerindeki düzey ölçümüyle; AMAÇLANAN;  SLE benzeri klinik tabloların tanısında  C2 yetersizliği yardımcı olur  Yineleyen bakteri enfeksiyonlarının tanısında  C3 yetersizliği yardımcı olur  Radyal immun difüzyon  RIA

109 Antijen + Kompleman Kompleman antijene bağlanmaz.
Kompleman + Antikor Kompleman antikora bağlanmaz. Antijen + Uygun antikor + Kompleman Kompleman birbirlerine bağlanmış olan uygun antijen antikor bileşiğine bağlanır.

110

111

112

113

114 Serum dilüsyonu 1. ve 2. sıra akut ve iyileşme dönemindeki hastalardan alınan serum örnekleri (2 kat serum dilüsyonu yapılmıştır.)

115 Hastalık Tanısı Amacı ile Kompleman Birleşmesi Deneyleri
İstenilen antijene karşı, hasta serumunda antikor araştırılarak hastalık tanısı konur. En çok kullanılan yöntemler Kolmer tekniği ve Wasserman tekniğidir.

116 Kompleman Birleşmesi Deneyinde Genel İlkeler
1. Kullanılmakta olan antijenlere göre deneyler makro ve mikro yöntemlerle uygulanmaktadır. Viral antijenler çok pahalı ve elde edilmeleri güç olduğundan özellikle bunlarda mikro yöntemlerle çalışılır. Makro yöntemlerde deneye konulan tüm ayıraç ve maddeler için 0.1, 0.2, 0.25, 0.5ml gibi birim hacimler ve daha çok 0.25ml hacimler kullanılır. Mikro yöntemlerde ise 0.025, 0.050ml ve daha çok 0.025ml hacimler kullanılır.

117 2. Makro ve mikro yöntem kullanılacağına göre deney 10 x 75 mm, 12 x 75 mm boyutlarındaki tüplerde, büyük çukurlu ya da mikro titrasyon apareyinin U çukurlu plastik tablalarında yürütülür.

118 3. Hasta serumları: Hastalardan aç karnına alınan serumların, berrak, hemolizsiz olmaları ve bakterilerle kontamine olmamaları gerekir. Serumların deney gününde 560C’de 30dk da tutularak inaktive edilmeleri ve soğukta bekletilmeleri gerekir. Deney gününde tekrar 10dk inaktive edilmeleri gereklidir. Serumlar kullanılacak yönteme göre fizyolojik tuzlu su ya da gerekli sulandırıcılarla sulandırılır.

119 4. Kompleman taze kobay serumu da olsa stoklanmış ya da ticaretten elde edilen liyofilize kompleman da olsa kullanım anına kadar soğukta (+40C’de) tutulmalıdır. Çalışma buz parçaları bulunan bir kap içerisinde yapılmalıdır. Deney gününde kompleman mutlaka titre edilmeli ve titresine uygun olarak kullanılmalıdır.

120 5. Antijen en az bir kez, pozitif seruma karşı titre edilmeli ve ona göre kullanılmalıdır. 6. Hemolitik sistem tirajının da deney gününde yapılması ve ona uygun titrajlarda kullanılması gereklidir. Hemoilitik serumlar tavşanların koyun eritrositleri ile bağışıklanmaları suretiyle üretilebilir.

121 Koyun Eritrositlerinin Hazırlanması
1. Koyun kanı hayvanın vena jugularisinden (Kafadan kalbe kan taşıyan, kafanın iki yanında bulunan büyük toplardamar) içinde (%10) sodyum sitrat eriyiğinden, alınacak kan hacminin 1/10’u kadar bulunan ya da içerisinde boncuk olan bir şişeye alınır. Kan ile sitrat eriyiği karışıncaya kadar, boncuklu şişede kan defibrine oluncaya kadar çevirme hareketleri ile karıştırılarak pıhtılaşması önlenir.

122 2. Koyun eritrositlerinin yıkanması: Taze defibirine ya da stoklanmış kandan bir miktar alınır. Arada bulunabilecek olan pıhtıların ayrılması için steril çift katlı gazlı bezden süzülür. Süzüntü, steril, sivri dipli ve bölüntülü santrifüj tüplerine konur. Üzerine steril fizyolojik tuzlu su konur. Alt üst edilerek karıştırılır. Santrifüjde 300 rpm’de 10dk santrifüjlenir.

123 3. Tüpleri horizontal çeviren santrifüj kullanılmalıdır
3. Tüpleri horizontal çeviren santrifüj kullanılmalıdır. Üstteki sıvı atılır. Yeniden tuzlu su konulup karıştırıldıktan sonra yine çevrilir ve bu işlem üç kez tekrarlanır. Sonuncu kez üstteki sıvı berrak olmalıdır.

124 3. Fizyolojik su ile süspansiyonu yapılır. 4
3. Fizyolojik su ile süspansiyonu yapılır. 4. Koyun eritrositleri stoklanabilir. Kompleman birleşmesi deneyinde kullanılacak koyun eritrositleri kullanım gününden 5 gün önce alınmış ve buzdolabında saklanmış olmaları daha uygun sonuçlar vermelerine neden olur.

125 Kompleman En standart ve iyi etkili kompleman, kobay serumlarında bulunduğundan KBD. de kompleman olarak bu hayvanların taze serumu kullanılır.

126 Kompleman Kompleman deney hayvanlarından çalışma gününde taze olarak elde edilebileceği gibi stok ya da ticaretten elde edilen liyofilize kompleman da kullanılabilir. Kompleman çalışma anına kadar buz üzerinde soğukta beklenir. Koyun eritrositlerine hemolitik etki gösteren kobay serumları bir gece +4 ile +10 derecelerde bekletilir.

127 Komplemanın Stoklanması
Dondurularak saklanan kobay serumları bir hafta etkinliğini kaybetmeden stoklanabilir. Rhamy – Sonnerschein yöntemi ile sodyum asetat, borik asit ile karıştırılarak 3-5 hafta saklanabilir. Sodyum klorür ile saklama 10ml kobay serumuna 1g saf NACI eklenerek 3-4 hafta sakalanır. Liyofilizasyon (dondurarak kurutma) ile uzun süre saklanabilir.

128 Kompleman Birleşmesi Deneylerinde Gerekli Şeyler
Hasta serumu Koyun eritrositleri süspansiyonu Serum hemolitik (hemolizin) Kompleman Antijen Sulandırıcı sıvı Serolojik tüpler, pipetler

129 Serum hemolitiğin sulandırılması ve titrasyonu
14 adet serolojik tüp alınır. Ayrı bir tüpe 9.9 ml sulandırıcı ve 0.1 ml hemolitik serum karıştırılarak 1:100’lük sulandırım elde edilir. Dizideki 1 ve 2.ci tüplere 0.5’er ml diğer tüplere sırasıyla 0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.3, 2.9, 0.5, 0.5 ml sulandırıcı eklenir. Birinci tüpe 1:100’lük hemolitik serum sulandırımından 0.5 ml konur, karıştırılır bunlardan ikinci tüpe aktarılır, karıştırılır ve pipet atılır. Burada H. serum 1:200 ve 1:400 sulanmıştır.

130 Serum hemolitiğin sulandırılması ve titrasyonu
Üçüncü tüpten 12.ci tüpe kadar tüm tüplere ayrı pipetlerle 0.1’er ml 1:100 sulanmış H. Serum konur ve her pipet ait olduğu tüp içine bırakılır.buraya kadar serum hemolitik 3.cü tüpte 1:600 ve sırasıyla 1:800, 1:1000, 1:1200, 1:1600, 1:1800, 1:2000, 1:2400, 1:3000 oranlarında sulandırılmıştır. 13.cü tüpe, 1:2000’lik sulandırımdan 0.5 ml eklenerek 1:4000’lik ve 14.cü tüpe 1:3000’lik sulandırımdan 0.5ml aktarılarak 1:6000’lüik sulandırım elde edilir.

131 Standart yöntemde hemolitik serumun titrasyonu deneyi
Serum hemolitiğin her sulandırımından 0.25 ml ayrı tüplere konur. Bir saat 370C’lik su banyosunda bekletilir.

132 Sonuçların okunması ve değerlendirilmesi
Kontrol tüplerinde; 16. tüpte kompleman konulmadığından hemoliz olmaz. 15. tüp kompleman kontrolü hemolitik serum olmadığından hemoliz yok. 17. tüp pozitif hemolitik serum kontrolü Titrasyon tüpleri; tam erime gösteren en dilüe serumdaki serum hemolitik sulandırımına bir minimal hemolitik doz (MHD) ya da bir hemolitik ünite adı verilir. Esas deneyde 3 MHD

133 Kolmer Yöntemi Kolmer yöntemi ile standart kompleman yöntemin uygulamaları aynıdır. Bazı farklar ise şunlardır; Sulandırıcı olarak tuzlu su yerine 0.1 mg magnezyum sülfat içeren tuzlu su kullanılır. Komplemanın 1:10 sulandırımından 1 birim hacim (o.25 ml) kullanılırken kolmerde 1:30 sulandırımda 2 birim hacim (0.50 ml) kullanılır.

134 3. Koyun eritrositlerinin %3’lük süspansiyonu kullanılmaktadır. 4
3. Koyun eritrositlerinin %3’lük süspansiyonu kullanılmaktadır. 4. Birinci evreden sonra orijinal kolmer yönteminde; hasta serumları + antijen + kompleman karışımları bir gece (15-18 saat) buzdolabında sonra 10dk oda sıcaklığında bekletilir. 5. Değerlendirme ve diğer uygulamalar temelde aynıdır.

135

136