ELEKTROFOREZ.

... konulu sunumlar: "ELEKTROFOREZ."— Sunum transkripti:

1 ELEKTROFOREZ

2 Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alan uygulandığında, sıvı içeren bir ortamda hareket hızlarının ölçüldüğü bir yöntemdir. Elektroforez tüm partikül türlerinin göçünü sağladığından iyontoforez terimi özellikle küçük iyonların göçünü ifade eder.

3 Makro molekülleri(özellikle nükleik asit ve proteinleri) birbirinden ayırmak bazen saflaştırmak için kullanılır.Molekülleri büyüklük, yük ve konformasyonlarına göre ayırmaya yarar.Biyokimya ve moleküler biyolojide uygulanan en yaygın yöntemdir.

4 En yaygın elektroforez uygulamaları, serum proteinleri, hemoglobinler ve izoenzimleri içerir. İzoenzimlerden ise, CK, LDH ve ALP en yaygın olarak kullanılandır. Piyasadaki yaygın elektroforez enstrüman üreticileri Beckman Instruments, Helena Laboratories ve Sebia Laboratories’e ait olanlardır.

5 Protein çalışmalarında kullanılan ilk elektroforez yöntemi Tiselius tarafından 1937’de tanımlanan serbest solüsyon elektroforezi,frontal elektroforez veya “moving boundary” elektroforezidir. Tiselius bir elektrolit solüsyonunda çözünmüş olan proteinleri, protein-elektrolit solüsyonunun bulunduğu “U” şeklindeki kuartz bir borunun içinden elektrik akımı geçirerek ayırmıştır.

6 pH 7.6’da albumin, α, β ve γ olarak isimlendirilen 4 serum protein fraksiyonunu saptamış ve bu bandların sınırları arasındaki absorbans değişikliğini optik olarak ölçmüştür. Bu teknik hala elektroforetik mobilite ve protein- protein etkileşimi ile ilgili araştırmalarda kullanılmaktadır; fakat,klinik laboratuvarlarda rutin çalışmalar için kullanılmaz, kompleks bir araç gerektirir,teknik zordur ve 0.5 mL örnek gerektirir.

7 Zonal elektroforez terimi sellüloz kağıt, sellüloz asetat veya agaroz jel gibi porlu bir destek ortamında yüklü makromoleküllerin göçünü gösterir.Zonal elektroforez, elektroforetik destek materyali üzerinde komşu zonlardan keskin sınırlarla ayrılmış bir elektroforetogram sağlar. Katı bir destek ortamında ve pH 8.6’da α fraksiyonu, α1 ve α2 olmak üzere iki gruba daha ayrılır.

8 Diğer destek ortamları olarak sellüloz asetat
membranı, agaroz jel, nişasta jel, poliakrilamid jel vb. kullanılmaktadır. Sellüloz asetat ve agaroz jel kullanım kolaylıkları, ucuz oluşları ve piyasadaki yaygınlıkları nedeniyle klinik laboratuvarlarda daha çok tercih edilir.

9 Elektroforez tamamlandıktan sonra destek ortamı bir boya ile muamele edilerek ayrılmış fraksiyonların identifikasyonu sağlanır. En yaygın kullanılan boyalar: Amido Black, Ponceau S, Fat Red 7B ve Sudan Black B’dir. Ayrılan fraksiyonların kaliteli bir profilinin elde edilmesi için dansitometri boyanmış destek ortamda gerçekleştirilir.

10 TEMEL PRENSİBİ Eksi yüklü moleküller(anyonlar) artı yüklü elektroda (katoda), artı yüklü moleküller(katyonlar) ise eksi yüklü elektroda (anota) hareket eder.Elektroforezde tampon sistem kullanılır ve bir ortam(kağıt,selüloz asetat,nişasta,agaroz jeli ya da poliakrilamit) ile bir doğru akım kaynağı gerekir.

11 DNA H  O2 + - Power + - Power

12 DNA DNA + - Power DNA small large

13 DANSİTOMETRİ Önceleri sonuçların değerlendirilmesinde; oluşan bantlar kesilip, her parçadaki boya ayrı ayrı çözülerek titrasyonla veya spektrofotometrik olarak miktarlarının saptanması yoluna gidilirken, artık daha çok doğrudan bantlardaki boya yoğunluğunu saptayan dansitometri sistemleri kullanılmaktadır.

14 Dansitometri temel olarak bir absorbans ölçümüdür
Dansitometri temel olarak bir absorbans ölçümüdür. Bir dansitometre bir destek ortamdaki boyanın absorbansını ölçer. Bir dansitometrenin temel bileşenlerini; ışık kaynağı, monokromatör, tüm plağın taranması için hareketli bir taşıyıcı, optik sistem ve bir fotodetektör oluşturur. Fotodetektörle saptanan sinyaller örneğin konsantrasyonuyla orantılı olan destekteki boyanın absorbansıyla ilişkilidir. Destek ortamı sabit bir hızla ışık demetinden geçirilir, böylece farklı noktalarda alınan çoklu dansite okumalarının sunduğu bir grafik oluşturulabilir.

15 Modern dansitometrelerin eğrinin altında kalan alanı bulabilen bilgi- işlemcileri vardır, böylece, tüm fraksiyonların miktarı saptanabilir. “The Beckman Appraise”, klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan dansitometrelerin bir örneğidir. Bu modelin hasta sonuçlarının rapor edilmesi ve yorumlanması için ayrıntılı bir veritabanı yönetim sistemi vardır.

16 ELEKTROFOREZ TÜRLERİ 1. Kağıt elektroforezi
2. Selüloz asetat elektroforezi 3. Jel elektroforezi a. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) b. Agaroz jel elektroforezi 4. Kapiller elektroforez

17 Agaroz Jel Elektroforezi
ELEKTROFOREZ’E BİR ÖRNEK: Agaroz Jel Elektroforezi Kullanılan malzeme ve ekipmanlar: Bir elektroforez tankı (chamber) ve güç kaynağı Jel tablası(Gel casting trays) Elektroforez çözeltisi Yüklü çözelti (loading buffer)

18 Agaroz deniz yosunlarından elde edilen bir şeker molekülü zinciridir.
Üreticiler bilimsel çalışmalar için özel toz formlar yapar ve oldukça da pahalıdır.

19 Electrical leads 

20

21

22 Jel hazırlanırken: Agaroz pudrası istenilen yoğunluktaki elektroforez çözeltisi(10X stok çözelti) ile karıştırılır. -Tamamen eriyene kadar fırında (microwave oven)ısıtılır. -Genellikle elektroforez sonrası DNA’yı görebilmek için son aşamada solusyona Etidyum bromur (10 mg/ml) eklenir. -Solusyonun yaklaşık 60°C’ye kadar soğuması beklenir -Katılaşmadan evvel içinde örnek tarağı bulunan jel tablasına dökülür. -Oda sıcaklığında katılaşması beklenir,şayet aceleyse buzdolabında da dondurulabil -Jel katılaştında,üzerinde oluşan çukurlukların parçalanmamasına itina göstererek tarak çıkarılır. -Hala plastik tablasında bulunan jel yatay olarak elektroforez tankına yerleştirilir -Islak kalması ve elektriği iletmesi için tank tampon çözeltiyle kaplanır

23

24

25

26

27 -Kullanılacak olan DNA yüklü çözelti ile karıştırılıp mikropipetler vasıtasıyla jel çukurlarına yüklenir. -Mikropipetler ile genellikle 5-10 μl yükleme yapılır. -Güç vericiler aparata bağlanıp akım verilir,böylece bir elektrik alan oluşturulur. -DNA’lar pozitif elektroda doğru göç etmeye başlayacaktır.

28

29 DNA  wells   buffer  Anode (positive) Cathode (negative)

30 -Yüklü çözeltide 2 tane belirleyici boya (the tracking dyes) olduğundan bahsetmiştik. Renkli boyaların göçüşünün izlenmesi ile de var olan DNA’nın göçüşü izlenebilir. Bunlar: Bromofenol blue ve xylene cyanol. Bunlar agaroz jelde 300 ile 4000 bp’lik çift zincirli DNA fragmentleri ile aynı yönde göçerler. -Blue (leading dye)oldukça hızlı olup jelin sonunda rahatlıkla görülür. -Kırmızı olan ise oldukça yavaştır. -Bizim DNA’mız ise bu iki belirleyicinin arasında bir yerde olması beklenir.

31 -Göçün tamamlandığından emin olunduğunda DNA parçaları etidyum bromid sayesinde izlenebilir. Çünkü EtBr bir interkalasyon ajanıdır: DNA’nın içine kendini çok küçük bir çizgi halinde yerleştirip orda kalır,üstelik de UV ışığının altında parlak bi bant halinde görülmeyi sağlar. Ayrıca EtBr,DNA’ya bağlanıp onun ağırlığını ve sertliğini değiştirdiği gibi onun hareket kabiliyetini de etkiler.

32 Marker: -Çeşitli tiplerde DNA büyüklük belirleyici markerlar var. -Markerlar kendi DNA’mızın büyüklüğünü görebilmek amaçlı kullanılan belirteçlerdir -Jele DNA’mızı yüklemeden önce markerlar yüklenir. -Eskiden en ucuz marker temin etmenin yolu bakteriyofaj DNA’sının restriksiyon enzimleri kesilmesiyle elde etmekti. -Şimdi bunları üretip satan şirketler var.

33

34 Voltaj: Genellikle ‘v/cm’ ile ifade edilip buradaki cm değeri jel uzunluğu değil, iki elektrot arası uzaklıktır. -Örneğin elektrotlar arası uzaklık 10 cm ise yürütme için 50V’luk elektrik verilir. -Ama genellikle TBE çözeltisi içindeki normal büyükteki jel için 30 dakika 100 V ‘luk akım uygulanır.

35 -Bir güç kaynağında voltajı,akımı ve de güç seviyelerini gösteren 3 bölüm vardır Yürütmenin sonunda güç kaynağı kapatılır. -Jel tankı karanlık bir odaya alınır ve UV ışık kutusunda incelenir.

36 Cathode (-)  wells  Bromophenol Blue DNA (-)  Anode (+)

37 Bu fotoğrafta görüldüğü gibi band numaraları çukurların üzerine yazılır.Böylece küçük parçalar fotoğrafın üstündedir çünkü onlar çok hızlı hareket ederler.Burada 4 ve 5.nci çizgiler standart çizgiler olarak belirlenmiş.Bu bantlar spesifik DNA‘lar olup kontrol amaçlı kullanılan markerlardır. Büyüklükleri bilinir.Örneğin 5. çizgideki DNA E.coli’nin lamda bakteriyofajı ile kesildi dolayısıyla uzunluğu tahmin edilebilir. DNA parçalarının büyüklükleri arasında logaritmik bir artış vardır. Standart çizgiler arasındaki uzaklığın ölçülmesiyle, biz kendi DNA’mızın standart eğrisini oluşturabiliriz.

38

39 KULLANIM ALANLARI • Saflaştırma • Saflık kontrolu
• Molekül ağırlığı saptama • Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama • Enzim izozimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için, adli tıpta) • İmmünolojik ve moleküler biyoloji

40 DİNLEDİĞİNİZ İÇİN   TEŞEKKÜRLER   