IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ

... konulu sunumlar: "IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ"— Sunum transkripti:

1 IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ
Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

2 Amaç Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme İn Vitro Araştırma Yöntemleri: Hücre biyolojisi çalışmaları, Moleküler biyoloji yöntemleri BAL, Balgam, Biyopsi çalışmalarının analizi Genetik analizler (pleomorfizm çalışmaları) Hücre kültürleri: Deneysel araştırmada in vitro yöntemler: Bunların neler olduğuna bak: Genel slayt koy, yöntemlerden bahset, sonra hücre kültürlerine gir, hücre kültürü çalışmalarında kullanılan in vitro yöntemlere geç: Permabilite ölçümü, CBF ölçümü, sitokin analizi, protein analizi, viabilite ölçümü, Flowcytometry, Western Blott, PCR, RT-PCR, Transfection nedir?, siRNA, proteomik analizi, genomik, transkripsiyon faktör aktivasyonu, immünositokimya, imaj analiz sistemleri. Sayılamayacak çok in vitro teknik var. Bunların bir kısmı balgam, BAL, biyopsi vs yoluyla alınan örneklerin çalışılmasında kullanılıyor. In vitro yöntemlerle laboratuar ortamında hücre elde edilip, yine in vitro yöntemler kullanılarak çeşitli analiz ve değerlendirmeler yapılıyor. Bu sunuda önce in vitro yöntem ile hücre kültürü yöntemiyle hücre elde edilmesini ve elde edilen hücreler ile yapılan deneylerde kullanılan in vitro yöntemlerden söz etmek istiyorum.

3 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

4 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

5 İn Vitro Araştırma Laboratuarı
Nasıl kurulur? Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK Profesyonel destek Personel; biyolog, teknisyen, asistan

6

7

8

9

10 İn vitro yöntemler nerede kullanılır?
İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs. Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs İn Vitro Araştırma Yöntemleri: Hücre biyolojisi çalışmaları, Moleküler biyoloji yöntemleri BAL, Balgam, Biyopsi çalışmalarının analizi Genetik analizler (pleomorfizm çalışmaları) Hücre kültürleri: Deneysel araştırmada in vitro yöntemler: Bunların neler olduğuna bak: Genel slayt koy, yöntemlerden bahset, sonra hücre kültürlerine gir, hücre kültürü çalışmalarında kullanılan in vitro yöntemlere geç: Permabilite ölçümü, CBF ölçümü, sitokin analizi, protein analizi, viabilite ölçümü, Flowcytometry, Western Blott, PCR, RT-PCR, Transfection nedir?, siRNA, proteomik analizi, genomik, transkripsiyon faktör aktivasyonu, immünositokimya, imaj analiz sistemleri. Sayılamayacak çok in vitro teknik var. Bunların bir kısmı balgam, BAL, biyopsi vs yoluyla alınan örneklerin çalışılmasında kullanılıyor. In vitro yöntemlerle laboratuar ortamında hücre elde edilip, yine in vitro yöntemler kullanılarak çeşitli analiz ve değerlendirmeler yapılıyor. Bu sunuda önce in vitro yöntem ile hücre kültürü yöntemiyle hücre elde edilmesini ve elde edilen hücreler ile yapılan deneylerde kullanılan in vitro yöntemlerden söz etmek istiyorum.

11 İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır?
Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’) ****Önce belli durumlarda istenen çalışmalar örn; Soluble ortamdaki (serum, BAL, hücre kültür sıvısı, BOS, idrar vs) bir proteinin kantitatif tayini, Daha sonra; tek tek yöntemler kısaca nedir, nasıl yapılır, temel mantığı nedir? Konusunda ayrı ayrı bilgi ver. En önemlisi bir kitap. Hücre kültürlerine geç, genel bir slayt ile hücre dizileri ve primer hücre kültürlerine değin, sonra kendi çalışmalarında kullandığın kültür modellerine değin ve kullandığın yöntemlerden kısaca örnekler ver. bahset, ve kullanılan yöntemlerden örnekler ver, kendi çalışmalarınla tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) to an insoluble formazan dye by mitochondrial enzymes associated with metabolic activity, indicating living cells.

12 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

13 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA)
(Substrat) (‘enzime bağlı secondary ab’) (‘detecting ab’) (Nümune) A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form. Because the ELISA can be performed to evaluate either the presence of antigen or the presence of antibody in a sample, it is a useful tool both for determining serum antibody concentrations (such as with the HIV test[1] or West Nile Virus) and also for detecting the presence of antigen. The steps of the general, "indirect," ELISA for determining serum antibody concentrations are: Apply a sample of known antigen of known concentration to a surface, often the well of a microtiter plate. The antigen is fixed to the surface to render it immobile. Simple adsorption of the protein to the plastic surface is usually sufficient. These samples of known antigen concentrations will constitute a standard curve used to calculate antigen concentrations of unknown samples. Note that the antigen itself may be an antibody. The plate wells or other surface are then coated with serum samples of unknown antigen concentration, diluted into the same buffer used for the antigen standards. Since antigen immobilization in this step is due to non-specific adsorption, it is important for the total protein concentration to be similar to that of the antigen standards. A concentrated solution of non-interacting protein, such as Bovine Serum Albumin (BSA) or casein, is added to all plate wells. This step is known as blocking, because the serum proteins block non-specific adsorption of other proteins to the plate. The plate is washed, and a detection antibody specific to the antigen of interest is applied to all plate wells. This antibody will only bind to immobilized antigen on the well surface, not to other serum proteins or the blocking proteins. The plate is washed to remove any unbound detection antibody. After this wash, only the antibody-antigen complexes remain attached to the well. Secondary antibodies, which will bind to any remaining detection antibodies, are added to the wells. These secondary antibodies are conjugated to the substrate-specific enzyme. This step may be skipped if the detection antibody is conjugated to an enzyme. Wash the plate, so that excess unbound enzyme-antibody conjugates are removed. Apply a substrate which is converted by the enzyme to elicit a chromogenic or fluorogenic or electrochemical signal. View/quantify the result using a spectrophotometer, spectrofluorometer, or other optical/electrochemical device. (‘capture ab’)

14 ELİSA

15 ImmunoSito/Histokimya
Bir antikor genellikle hücresel bir antijene bağlanır ve mikroskop altında kolay görünmesini sağlar. İmm histokimya doku üzerindeki antijeni görmek içindir. •Enzyme-Mediated •Fluorescence Immunohistochemistry/ Immunocytochemistry อ.ธนเศรษฐ์ Ref: -an antibody is used to link a cellular antigen specifically to a stain that can be more readily seen with a microscope. •Immunohistochemistry ---->Detection of antigens in tissues •Immunocytochemistry ---->Detection of antigens in cultured cells -optimal conditions for immunohistochemicalor immunocytochemicaldetection must be determined for each individual situation •dependent on ---->antigen availability, antigen antibody affinity, antibody Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi

16 Immunohistochemistry/ Immunocytochemistry
อ.ธนเศรษฐ์ Ref: -an antibody is used to link a cellular antigen specifically to a stain that can be more readily seen with a microscope. •Immunohistochemistry ---->Detection of antigens in tissues •Immunocytochemistry ---->Detection of antigens in cultured cells -optimal conditions for immunohistochemicalor immunocytochemicaldetection must be determined for each individual situation •dependent on ---->antigen availability, antigen antibody affinity, antibody

17 ‘Blotting’ (leke) Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans)
Western blot; protein antibody ile Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile Southwestern blot: DNA bağlı protein Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile A Southern blot is a method routinely used in molecular biology to check for the presence of a DNA sequence in a DNA sample. Southern blotting combines agarose gel electrophoresis for size separation of DNA with methods to transfer the size-separated DNA to a filter membrane for probe hybridization. The method is named after its inventor, the British biologist Edwin Southern.[1] Other blotting methods (i.e., western blot, northern blot, southwestern blot) that employ similar principles, but using RNA or protein, have later been named in reference to Southern's name. The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression. It takes its name from the similarity of the procedure to the Southern blot procedure, named for biologist Edwin Southern, used to study DNA, with the key difference that, in the northern blot, RNA, rather than DNA, is the substance being analyzed by electrophoresis and detection with a hybridization probe. Southwestern blotting, based along the lines of Southern blotting (which was created by Edwin Southern) and first described by B. Bowen and colleagues in 1980, involves identifying and characterizing DNA-binding proteins (proteins that bind to DNA) by their ability to bind to specific oligonucleotide probes. Far-Western blotting is a molecular biological method which is based on the technique of Western blotting. While usual Western blotting uses an antibody to detect a protein of interest, far-Western blotting uses a non-antibody protein, which can bind the protein of interest. Thus, whereas Western blotting is used for the detection of certain proteins, far-Western blotting is rather employed to detect protein:protein interactions.

18 Western Blot (Immunoblot)
Doku homojenatı/ekstraktı, hücre Spesifik proteini, düzeyini belirlemek Western blot From Wikipedia, the free encyclopedia Jump to: navigation, search A Western blot. The western blot (alternately, immunoblot) is a method to detect a specific protein in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) (Figure 1) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein. There are now many reagent companies that specialise in providing antibodies (both monoclonal and polyclonal antibodies) against many thousands of different proteins. Commercial antibodies can be expensive, though the unbound antibody can be reused between experiments. This method is used in the fields of molecular biology, biochemistry, immunogenetics and other molecular biology disciplines. Other related techniques include using antibodies to detect proteins in tissues and cells by immunostaining and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The method originated from the laboratory of George Stark at Stanford. The name western blot was given to the technique by W. Neal Burnette[1] and is a play on the name Southern blot, a technique for DNA detection developed earlier by Edwin Southern. Detection of RNA is termed northern blotting.

19 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polimeraz Zincirleme Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun kosullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit in vitro klonlama olarak da tanımlanan PCR; 94°C-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37°C-65°C aralığında gerçekleştirilen 'annealing' ve 72°C’de gerçekleştirilen elangasyon aşamalarından oluşur ve bu siklusların belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ayrıca PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin bulunması yapmıştır zira bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen yegane enzimdir. Bu enzim Kızıldeniz'in sıcak bölgelerinden birinde yaşayan bir mikroorganizmadan elde edilmiştir. Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel ödülü almıştır. PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR'a dayalı RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde türiçi ve türlerarasında kullanılmaktadır.

20 Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Quantitative real time polymerase chain reaction (QRT-PCR) Kinetic polymerase chain reaction Hedef DNA’yı eş zamanlı olarak amplifiye ve kuantifiye eder. Anahtar özellik, amplifiye edilen DNA biriktikçe, her amplifikasyon siklüsü sonrasında eş zamanlı olarak ölçülebilmektedir Karşılaştırma yapılabilmektedir In Molecular Biology, real-time polymerase chain reaction, also called quantitative real time polymerase chain reaction (QRT-PCR) or kinetic polymerase chain reaction, is a laboratory technique based on polymerase chain reaction, which is used to amplify and simultaneously quantify a targeted DNA molecule. It enables both detection and quantification (as absolute number of copies or relative amount when normalized to DNA input or additional normalizing genes) of a specific sequence in a DNA sample. The procedure follows the general principle of polymerase chain reaction; its key feature is that the amplified DNA is quantified as it accumulates in the reaction in real time after each amplification cycle. Two common methods of quantification are the use of fluorescent dyes that intercalate with double-strand DNA, and modified DNA oligonucleotide probes that fluoresce when hybridized with a complementary DNA. Frequently, real-time polymerase chain reaction is combined with reverse transcription polymerase chain reaction to quantify low abundance messenger RNA (mRNA), enabling a researcher to quantify relative gene expression at a particular time, or in a particular cell or tissue type. Although real-time quantitative polymerase chain reaction is often marketed as RT-PCR, it should not to be confused with reverse transcription polymerase chain reaction, also known as RT-PCR.

21 Microarray (Mikrodizi)
DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays Protein mikroarray Tissue mikroarray Transfection mikroarray (hücre microarray) Kimyasal bileşik mikroarray Antibody mikroarray Gene Chip Analizleri Microarray is a powerful tool for genome analysis. It gives the global view of the genome analysis in a single experiment. Data analysis in the Microarray is a vital part as this part influences the final result. Each microarray experiment yields at least thousand data points. Each microarray study comprises multiple microarray experiments, each microarray study would give tens of thousands of data points.

22 DNA Mikroarray Gen/genom chip, DNA chip, gen array
Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar. A DNA microarray (also commonly known as gene or genome chip, DNA chip, or gene array) is a collection of microscopic DNA spots, commonly representing single genes, arrayed on a solid surface by covalent attachment to a chemical matrix. DNA arrays are different from other types of microarray only in that they either measure DNA or use DNA as part of its detection system. Qualitative or quantitative measurements with DNA microarrays utilize the selective nature of DNA-DNA or DNA-RNA hybridization under high-stringency conditions and fluorophore-based detection. DNA arrays are commonly used for expression profiling, i.e., monitoring expression levels of thousands of genes simultaneously, or for comparative genomic hybridization. In spotted microarrays, the probes are oligonucleotides, cDNA or small fragments of PCR products that correspond to mRNAs. The probes are synthesized prior to deposition on the array surface and are then "spotted" onto glass. A common approach utilizes an array of fine pins or needles controlled by a robotic arm that is dipped into wells containing DNA probes and then depositing each probe at designated locations on the array surface. The resulting "grid" of probes represents the nucleic acid profiles of the prepared probes and is ready to receive complementary cDNA or cRNA "targets" derived from experimental or clinical samples. mRNA or gene expression profiling - Monitoring expression levels for thousands of genes simultaneously to study the effects of certain treatments, diseases, and developmental stages on gene expression. For example, microarray-based gene expression profiling can be used to identify disease genes by comparing gene expression in diseased and normal cells. Comparative genomic hybridization - Assessing genome content in different cells or closely related organisms. [4] [5] SNP detection arrays - Identifying single nucleotide polymorphism among alleles within or between populations.[6] Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies - Determining protein binding site occupancy throughout the genome, employing ChIP-on-chip technology.

23 Genomic Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması
Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) tespitine dayalı çalışmalar Genomics is the study of an organism's entire genome. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome. In contrast, the investigation of single genes, their functions and roles, something very common in today's medical and biological research, and a primary focus of molecular biology, does not fall into the definition of genomics, unless the aim of this genetic, pathway, and functional information analysis is to elucidate its effect on, place in, and response to the entire genome's networks.

24 Proteomic ‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır
Genel olarak protein çalışmaları (yapı ve fonksiyonları) ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur. Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler Proteomics is the large-scale study of proteins, particularly their structures and functions.[1][2] Proteins are vital parts of living organisms, as they are the main components of the physiological metabolic pathways of cells. The term "proteomics" was coined to make an analogy with genomics, the study of the genes. The word "proteome" is a blend of "protein" and "genome". The proteome is the entire complement of proteins produced by an organism or system. This will vary with time.

25 Small Interfering RNA (siRNA)
‘short interfering RNA’ veya ‘silencing RNA’ Spesifik rolleri olan nükleotid uzunluğunda çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur. siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) kullanılabilir Small interfering RNA (siRNA), sometimes known as short interfering RNA or silencing RNA, are a class of nucleotide-long double-stranded RNA molecules that play a variety of roles in biology. Most notably, siRNA is involved in the RNA interference (RNAi) pathway where the siRNA interferes with the expression of a specific gene. In addition to their role in the RNAi pathway, siRNAs also act in RNAi-related pathways, e.g. as an antiviral mechanism or in shaping the chromatin structure of a genome; the complexity of these pathways is only now being elucidated. Each strand has a 5' phosphate group and a 3' hydroxyl (-OH) group. This structure is the result of processing by dicer, an enzyme that converts either long dsRNAs or small hairpin RNAs into siRNAs.[3] SiRNAs can also be exogenously (artificially) introduced into cells by various transfection methods to bring about the specific knockdown of a gene of interest. Essentially any gene of which the sequence is known can thus be targeted based on sequence complementarity with an appropriately tailored siRNA. This has made siRNAs an important tool for gene function and drug target validation studies in the post-genomic era.

26 Flow Cytometry DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)
Apopitozis çalışmalarında Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) Kromozom analiz ve tespitinde RNA çalışmalarında Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda volume and morphological complexity of cells cell pigments such as chlorophyll or phycoerythrin DNA (cell cycle analysis, cell kinetics, proliferation etc.) RNA chromosome analysis and sorting (library construction, chromosome paint) protein expression and localization transgenic products in vivo, particularly the Green fluorescent protein or related fluorescent proteins cell surface antigens (Cluster of differentiation (CD) markers) intracellular antigens (various cytokines, secondary mediators etc.) nuclear antigens enzymatic activity pH, intracellular ionized calcium, magnesium, membrane potential membrane fluidity apoptosis (quantification, measurement of DNA degradation, mitochondrial membrane potential, permeability changes, caspase activity) cell viability monitoring electropermeabilization of cells oxidative burst characterising multidrug resistance (MDR) in cancer cells glutathione various combinations (DNA/surface antigens etc.)

27 support/training/online/ITF/index.shtml

28 Akım Sitometri (Flow Cytometry)
Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir Çevredeki detektörler ışığın kırılma yönü, yaydığı floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır

29 Hücre Siklüs Ölçümü

30 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

31 Hücre Kültürleri İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları
Uygun çalışma modeli Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

32 Hücre Dizileri (‘cell line’)
Avantajları; Elde edilmeleri kolay İstendiği kadar çoğaltılabilir Saklanabilir, tekrar kullanılabilir Belli pasaj aralıkları kullanılmalı Dezavantajları; Bir takım genotipik ve fenotipik özellikleri in vivo hücrelerden farklıdır Hücre dizilerinin (‘cell line’) en önemli avantajları; elde edilmelerinin kolay oluşu, istendiği kadar çoğaltılabilmeleri, iastendiğinde saklanıp tekrar kullanılabilmeleridir. Dezavantajları ise; bir takım genotipik ve fenotipik özellikleri in vivo hücrelerden farklı olup, invivo hücreleri yeterince temsil edememe sorunu vardır.

33 Hücre Dizileri (‘Cell line’)
Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40); BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) Kanserleşmiş hücreler kullanılır A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) Herhangi bir doku veya organdan alınacak numune hemen herzaman birden fazla hücre tipini bir arada bulundurur. Bu nedenle spesifik bir tip hücreden bir hücre popülasyonu elde edebilmek için hücre biyologları çeşitli yöntemler geliştirmişlerdir. Eğer hücreler kompakt bir dokunun içinde yer alıyorlarsa (örneğin, hava yolu epitel hücreleri), önce etraftaki dokudan serbestleştirilmeleri gerekir. Bu mikroskop altında diseksiyon yöntemiyle olabildiği gibi, tripsin gibi çeşitli enzimlerin yardımıyla yapılabilmektedir. Sonraki aşamada bu hücrelerin bir birinden ayrılması gerekebilmektedir. Bu aşamada akım sitometri cihazlarının yardımıyla floresan aktive edilmiş hücre ayırma yöntemleri kullanılabilmektedir. İzole edilen bu hücrelerin kültür ortamında çoğaltılmaları sonucu ortaya çıkan hücre kültürlerine, primer kültürler denmektedir. Ancak vertebralı canlıların çoğunun hücreleri belli sayıdaki bölünmeden sonra çoğalamaz. Örneğin insan fibroblastları kültür ortamında kez bölünürler. Bu özellikten dolayı hücrelerimiz sonsuza kadar çoğalma yeteneği kazanıp kanserleşmezler. Bununla beraber, laboratuar ortamında bu hücreler telomerazlarının katalitik alt ünitelerini kodlayan gen ile bir araya getirilerek sonsuza dek üreme yetenekleri kazandırılabilir. Böylece genetik değişiklik sonucu sonsuza dek bölünme özelliği kazanan hücrelere immortalize (ölümsüzleştirilmiş) hücreler denmekte ve kültür ortamında hücre dizileri (‘cell line’) olarak adlandırılmaktadırlar. Bu hücreler laboratuar ortamında istendikleri miktarlarda çoğaltılıp kullanılabilirler. Buna karşın, A549 hücreleri insan akciğer karsinoma hücrelerinden elde edilmişlerdir, daha çok alveolar epitel hücre özellikleri taşırlar. Bunlardan başka, solunum yollarının ve akciğerin çeşitli hücrelerinden diziler elde edilmiştir. NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

34 DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine Tek katman (‘monolayer’) oluşturur
A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)

35 Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4m)
DEP (mass median aerodynamic diameter 5 0.4 m m, geometric standard deviation 0.195 m and 1.42 m)

36 Hücre Canlılığı - MTT Dizel Egzoz Partikülleri (g/ml) 50 100 200 400
SF FCS %10 5 10 Dizel Egzoz Partikülleri (g/ml)

37 DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi
24 saat DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi ***p< g/ml DEP 72 saat 48 saat Biz de bu durumu açıklığa kavuşturmak amacıyla DEP’nin insan alveolar epitel (A549) hücre dizileri üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladık. Koyu barlar pzoitif kontrol olarak %10’luk serum ortamında bulundurulan hücreleri gösteriyor. Gördüğünüz gibi değişik konsantrasyonlardaki DEP’leri insan A549 hücrelerinin canlılığını artırdı. Incubation with 5-200ug/ml DEP led to significant increase in the viability of A549 cells following 48 and 72hrs incubation. In contrast incubation for 24 hrs did not significantly alter viability of A549 cells

38 DEP (10-1000g/ml) ile 72s İnkübasyonun A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi

39 DEP (10g/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi
SF A549 hücre canlılığındaki artışın hücre siklüs progresyonu yani hücre proliferasyonu ile ilgili olup olmadığını araştırmak istedik. Görüldüğü üzere DEP G0/1 yani dinlenme fazındaki hücre oranını anlamlı olarak azaltırken, S fazındaki (yani protein sentezini artırarak bölünmeye hazırlanan) hücre sayısını anlamlı olarak artırdı. We wanted to see whether the DEP-induced effect on cell viability was related to cell cycle progression. As you see, of DEP led to a significant increase in percentage of cells being in S phase of cell cycle, as compared to SF treated cells. In contrast, the number of cells in G0/1 was significantly inhibited by DEP Bayram H et al, Eur Respir J 2006

40 DEP (10g/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi
SF Bu süreçte hücre apoptozisinin etkilenip etkilenmediğini anlayabilmek için, DEP ile inkübe edilen hücreleri A/PI ile boyadık ve flow sitometri ile yaptığımız incelemede, boyanmayan, yani canlı olarak kabul edilen hücre oranının anlamlı olarak arttığını, buna karşın hem Annexin 5 hemde PI ile boyanan, yani geç apoptotik ve erken nekrotik olarak değerlendirilen, hücre sayısında anlamlı bir azalmaya yol açtığını saptadık. Buda DEP’nin hücre apoptozisini baskıladığını düşündürmektedir. When we looked effects of DEP on apoptosis of A549 cells, we have seen that DEP significantly increased percentage of viable cells (A-, P-). Incontrast, 10ug/ml DEP significantly decreased number of cells positively staining with both An and PI indicating late apoptosis. T24 çalışılmadı. Çünkü viabilite datası t48’de alındı. Ancak %3.3 FCS eklendiğinde genellikle apoptosis/nekrozis doğrultusunda bir eğilim saptandı. *P<0.05 and **P<0.005 vs SF Bayram H et al, Eur Respir J 2006

41 DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi
DEP (g/ml) 10% FCS p21CIP1/WAF1 -actin * ** Bu süreçte DEP’nin hücre siklüsünü düzenleyen ve ekspresyonu arttığında hücre apoptozisini indükleyen p21 protein ekspresyonu üzerine bir etkisinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık. Görüldüğü üzere özellikle 10ug/ml DEP p21 ekspresyonunu anlamlı olarak baskıladı. Benzer şekilde RT_PCR sonuçlarımızda p21 mRNA düzeyinin DEP tarafından baskılandığını gösterdi. * p<0.05 and ** p<0.01 vs 0g/ml DEP treated cells. *P<0.05 and **P<0.01 vs 0g/ml DEP 10% FCS

42 DEP (10g/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi
*P<0.05 vs SF Similarly, our real time PCR results shown that DEP significantly inhibited p21 mRNA expression

43 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

44 Primer Hücreler-Avantajlar
İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

45 Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar
Elde edilmeleri daha zor Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar Etik sorunlar

46 Doku - Hücre Kaynağı Cerrahi eksplant Biyopsi
Pnömonektomi, Lobektomi Transplant akciğeri Biyopsi Fırçalama (epitel hücreler) Enzimatik digestion, Disseksiyon Hazır, ticari olarak

47 Akciğerin Primer Hücre Kültürleri
Düz kas hücreleri Fibroblast kültürleri Alveolar epitel hücreleri Bronş epitel hücreleri İn Vitro Araştırma Yöntemleri: Hücre biyolojisi çalışmaları, Moleküler biyoloji yöntemleri BAL, Balgam, Biyopsi çalışmalarının analizi Genetik analizler (pleomorfizm çalışmaları) Hücre kültürleri: Deneysel araştırmada in vitro yöntemler: Bunların neler olduğuna bak: Genel slayt koy, yöntemlerden bahset, sonra hücre kültürlerine gir, hücre kültürü çalışmalarında kullanılan in vitro yöntemlere geç: Permabilite ölçümü, CBF ölçümü, sitokin analizi, protein analizi, viabilite ölçümü, Flowcytometry, Western Blott, PCR, RT-PCR, Transfection nedir?, siRNA, proteomik analizi, genomik, transkripsiyon faktör aktivasyonu, immünositokimya, imaj analiz sistemleri. Sayılamayacak çok in vitro teknik var. Bunların bir kısmı balgam, BAL, biyopsi vs yoluyla alınan örneklerin çalışılmasında kullanılıyor. In vitro yöntemlerle laboratuar ortamında hücre elde edilip, yine in vitro yöntemler kullanılarak çeşitli analiz ve değerlendirmeler yapılıyor. Bu sunuda önce in vitro yöntem ile hücre kültürü yöntemiyle hücre elde edilmesini ve elde edilen hücreler ile yapılan deneylerde kullanılan in vitro yöntemlerden söz etmek istiyorum.

48 Hava Yolu Düz Kas Hücreleri
Fig. 3. Immunofluorescent staining of cultured HTSMC (passage one) with anti-alpha-smooth muscle actin monoclonal antibody (green) and DAPI (blue), 200X.

49 Hava Yolu Fibroblast Kültürleri Figure 1. Angiotensin type 1
receptor expression human fetal (a) and adult (c) lung fibroblasts in culture. Indirect double layer immunofluorescence using a polyclonal rabbit antibody to the human AT1 receptor was employed to demonstrate expression in quiescent subconfluent fibroblast monolayers. Rabbit IgG served as control primary antibody to demonstrate nonspecific staining in both fetal (b) and adult (d) cultures. Angiotensin II Is Mitogenic for Human Lung Fibroblasts via Activation of the Type 1 Receptor RICHARD P. MARSHALL, ROBIN J. Mc ANULTY, and GEOFFREY J. LAURENT Am J Respir Crit Care Med Vol 161. pp 1999–2004, 2000

50 Alveol Epitel Hücre Kültürleri
Alveol epitel Hücreleri ( Tip I ) Bazal membran Fig. 3. Immunostaining of human AT II cells grown on collagen I-coated Transwell membrane with a type II cell antibody. Top: human AT II cell staining with (left) and without (right) primary antibody. Bottom: electron microscopy of AT II cells showing lamellar bodies and microvilli. Arrow: lamellar body being secreted. Bar 1 m. Contribution of CFTR to apical-basolateral fluid transport in cultured human alveolar epithelial type II cells Xiaohui Fang,1 Yuanlin Song,1,2 Jan Hirsch,1 Luis J. V. Galietta,3 Nicoletta Pedemonte,3 Rachel L. Zemans,1 Gregory Dolganov,2 A. S. Verkman,1,2 and Michael A. Matthay1 Alveol epitel Hücreleri ( TipII )

51 Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri
Fırçalama, Enzimatik digestion, Disseksiyon

52 Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

53 Kültür Vasatı ‘Medium 199’
Foetal bovine serum (2.5ml) 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) 1ml human transferrin (2.5 g/ml) 1ml epidermal growth factor (20g/ml) 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir

54 Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik
kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

55 24-Kuyucuklu Plate

56 1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
Kültür kabına (3-6cm Falcon kültür kapları) konduktan 1 hafta içinde hücreler eksplanttan çoğalmaya başladılar. (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskobu, x300 büyütme) 1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

57 Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümü
D S Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümüne bakılacak olursa, silya ve mikrotübülüler görünmekte. Yine bu hücrelerin tıpkı in vivo epitelyuma benzer şekilde desmozomal yapılar geliştirdikleri, dolayısıyla in vivo hücrelere benzer morfolojik özellikler gösterdikleri görülmektedir. S D x56,000 x30,000

58 Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

59 Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

60 DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi
DEP ile yaptığımız çalışmalarda, öncelikle bu partiküllerin cerrahi eksplantlardan elde ettiğimiz bronş epitel hücre kültürlerinin silya titreşim frekansı üzerine olan etkisini araştırdık. Gördüğünüz gibi ug/ml konsantrasyonundaki DEP 2.saaten sonra BEHlerin STF anlamlı bir şekilde inhibe etti. Bu etkinin pertiküllerin mekanik etkisine mi yoksa partiküllerin üzerine adsorbe olan maddelerden mi kaynaklandığını anlayabilmek için; karbon partiküllerini ve filtre edilerek partiküllerden arındırılmış DEP solüsyonunu kontrol olarak kullandık. Gördüğünüz gibi karbon partikülleri herhangi bir etki göstermezken, filtre edilmiş DEP solüsyonu STF’nı anlamlı olarak baskıladı. Benzer şekilde bu hücrelerden inflamatuar mediatör (IL-8, GM-CSF ve sICAM-1) salınımı DEP ile inkübasyon sonunda anlamlı olarak arttı. i Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.

61 Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/g selüler protein Non-ast. Ast. (log.) p<0.05 p<0.003 p<0.002 İki gruptan elde ettiğimiz BEH’den standart kültür ortamında mediatör salınımına baktığımızda, astmatik hücrelerden anlamlı derecede yüksek oranlarda IL-8, GM-CSF, RANTES ve sICAM-1 gibi pro-inflamatuar mediatör salgıladıklarını gördük. Bu da astımlıların BEH’nin biyokimyasal özellikler açısından nonastmatiklerin hücrelerinden farklı olduğunu göstermektedir. YK IL GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

62 İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği
%5 CO2 İn Air NO2 Hücre kültürlerini çeşitli hava kirleticilerine maruz bıraktığımız sistemlerde, öncelikle

63 Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

64 Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

65 Sunu Akışı Giriş; Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

66 Özet Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı
İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir Solunum yolu hücrelerinin Fizyolojik Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir

67 Yorum Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız

68 TEŞEKKÜR Dicle Üniversitesi European Respiratory Society
St Bartholomew’s Hospital Prof RJ Davies Dr JL Devalia RJ Sapsford Dr OA Khair Dr MA Abdelaziz Dr C Rusznak Japonya Dr M Sagai Dr T Ohtoshi Dr Y Miyabara Dr H Takena NHLI-Imperial College Prof KF Chung Dr K Ito Dr R Issa Prof PJ Barnes European Respiratory Society Dicle Üniversitesi

69 TEŞEKKÜR Gaziantep Üniversitesi Prof. Dr. Erhan Ekinci
Doç. Dr. Öner Dikensoy Biol. Bülent Göğebakan

70 Sabrınız İçin Teşekkür Ederim