Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilere gen aktarımı

... konulu sunumlar: "Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilere gen aktarımı"— Sunum transkripti:

1 Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilere gen aktarımı
Sebahattin ÖZCAN Bu bölümdeki tüm bilgiler Özcan vd. 2002’den alınmıştır.

2 Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Aktarımında Kullanılması
Daha önce de belirtildigi gibi, gen aktarımı için T-DNA’nın sağ sınır nükleotid dizisi ile vir ve chv genleri mutlak gereklidir. Öte yandan, T-DNA bölgesinde bulunan ve opin sentezini sağlayan genler ile tümör oluşumuna neden olan onc genlerinin T-DNA’nın aktarımında işlevleri bulunmamaktadır. Bu genlerin T-DNA bölgesinden kesici enzimler ile çıkartılarak yerlerine yabancı genlerin klonlanmasının gen aktarımını kesinlikle etkilemediği görülmüştür.

3 Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Aktarımında Kullanılması
T-DNA aktarımı, son derece düşük oranda gerçekleştiği için gen aktarılmış hücrelerin ve dolayısıyla transgenik bitkilerin normallerinden ayrılması hemen hemen imkansız olmaktadır. Gen aktarılmış hücrelerin ve bunlardan gelişen sürgünlerin seçimi için seçici işaret (markör) genleri geliştirilmiştir. Bu markör genler, bitki hücre ve dokularına bazı antibiyotik veya herbisitlere karşı dayanıklılık kazandırmaktadırlar.

4 Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Aktarımında Kullanılması
Antibiyotik ya da herbisitlerin bulunduğu doku kültürü ortamlarında, normal bitki hücreleri antibiyotik ve herbisitlere karşı duyarlı olmasından dolayı gelişememekte, sadece seçici işaret genlerinin aktarıldığı bitki hücreleri gelişip çoğalabilmektedir. Dolayısıyla, gen aktarımı son derece düşük frekansta gerçekleşse dahi, gen aktarımı yapılan hücre ve dokulardan transgenik bitkiler elde edilebilmektedir.

5 İşaret (Markör) genleri
Seçici yapıdaki işaret genleri çoğunlukla bakteriyel kökenli olup, bunlar T-DNA bölgesinden veya diğer kaynaklardan elde edilen promotor ve terminatör baz dizileri arasına yerleştirilerek bitkilerde fonksiyonel duruma getirilmiştir. En yaygın kullanılan promotor bölgesi ise karnıbahar mozaik virüsünden izole edilen konstitütif CaMV 35S promotorudur.

6 İşaret Geni Kodladığı Enzim Dayanıklılık Antibiyotik NptII Neomisin fosfotransferaz Kanamisin Neomisin Hpt veya aph IV Higromisin fosfotransferaz Higromisin Herbisit Bar Fosfinotrisin asetil transferaz Fosfinotrisin Aro A 5-fenolpirüvilşikimat-3-fosfat sentaz Glifosat Raportör Gen Gfp Yeşil floresan proteini Gus -glukuronidaz Npt II Luc Lusiferaz

7 Gen Aktarımında Kullanılan Seçici İşaret Genleri
Marker gene Origin Enzyme encoded Substrate Neomycin Phospho- transferase (NPT) gene II Tn5 (E. coli) Neomycin Phosp- hotransferase II Kanamycin, Neomycin, G418 gene I Tn601 hotransferase I Hygromycin Phospho- transferase (HPT) gene E. coli Hygromycin Phosphotrans- ferase Hygromycin B Mutated mouse dihydrofolate reductase (DHFR) gene Mouse Dihydrofolate reductase Methotrexate Bacterial dihydrofolate reductase (DHER) gene Plasmid R6 aroA gene Salmonella typhimurium EPSP synthase Glphosate bar gene Streptomyces hygroscopicus Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinotricin bialaphos Octopine synthase gene (ocs)* T-DNA Octopine synthase Toxic opine precursor analogues Bleomycin resistance Bleomycin Streptomycin phospho- transferase gene Streptomycin phosphotrans-ferase Streptomycin Sulfonamide resistance Plasmid R46 Mutated dihyd- dropteroate synthase Sulfonamides

8 Vektör (Plazmid) Sistemleri
Tarımsal özelliklerini iyileştirmek amacıyla bitkilere aktarılmak istenen gen ya da genler ile işaret genlerinin doğrudan Ti plazmidlerinin T-DNA bölgesine klonlanması pratikte pek mümkün olmamaktadır. Bu durum, Ti plazmidlerinin büyüklüklerinden ve düşük kopya sayılarından kaynaklanmaktadır. Karşılaşılan bu sorunu aşmak için “ko-entegratif” ve “binari” (ikili) vektör sistemleri geliştirilmiştir. Bu vektörler hem E. coli, hem Agrobacterium ve hem de bitkide fonksiyonel olacak şekilde tasarlanmıştır.

9 Ko-entegratif (cis) vektörler
Ko-entegratif vektör (plazmid) sisteminde, sınır bölgeleri kalacak şekilde Ti plazmidinin T-DNA bölgesinin büyük bölümü çıkartılarak (bu vektöre alıcı vektör adı verilmektedir) yerine, küçük bir E. coli klonlama plazmidine (aracı) homolog yapıda bir DNA parçası yerleştirilmektedir.

10 Ko-entegratif (cis) vektörler
Aracı vektörlerin önemli bir kısmı E. coli’nin ColE1 plazmidinden türetilmiştir. Bu aracı plazmid sadece E. coli içerisinde replike olabilme yeteneğine sahip olup, Agrobacterium içerisinde replike olmaması gerekmektedir. Bitkilere aktarılacak genler, işaret geni ile birlikte önce bu aracı plazmidlere E. coli içerisinde klonlanırlar. Daha sonra aracı plazmidler, alıcı (reseptör) vektörün bulunduğu A. tumefaciens’e aktarıldıklarında, tek homolog rekombinasyon ile Ti plazmidinin T-DNA bölgesine entegre olurlar.

11 Ko-entegratif (cis) vektörler
Standart aracı vektörlerin özellikleri Bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolayca klonlanabileceği klonlama bölgesi. E. coli ve Agrobacterium’da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni. Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni. E. coli içerisinde fonksiyonel olan, ancak Agrobacterium’da etkili olmayan bir replikasyon orijini.

12

13 İkili (binari/trans) vektörler
Vir bölgesinin trans-hareket özelliğinden yararlanarak ikili (binari) vektörler geliştirilmiştir. İkili vektör sistemi, Agrobacterium içerisinde birbirinden bağımsız olarak replike olan iki plazmidten oluşmaktadır.

14 İkili (binari/trans) vektörler
Bunlardan ilki; T-DNA bölgesinin tamamının çıkartıldığı ve yalnızca vir bölgesini taşıyan Ti plazmidi (vir helper),

15 İkili (binari/trans) vektörler
diğeri ise T-DNA sınır bölgeleri içersinde bitkilere aktarılmak istenen genleri taşıyan, maniplasyonu kolay olan, küçük ve hareketli bir (ikili) plazmidtir. T-DNA bölgesi çıkartılan yardımcı Ti plazmidinde bulunan vir genleri, trans-hareket özellikleri sayesinde ikili vektörde bulunan T-DNA bölgesini bitki hücrelerine aktarmaktadırlar.

16 İkili (binari/trans) vektörler
Bir ikili vektörde bulunan standart özellikler; T-DNA içerisinde bulunan ve bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolaylıkla klonlanabileceği bir klonlama bölgesi. Hem E. coli, hem de Agrobacterium’da fonksiyonel olan replikasyon orijini (örnek: RK2). E. coli ve Agrobacterium’da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni. Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni. İkili vektörün konjugasyonla Agrobacterium’a aktarımı için gerekli olan transfer fonksiyonları (örnek: oriV, oriT ve trfA doğrudan DNA aktarımında gerekli değildirler). T-DNA sınır bölgeleri (sadece sağ sınır yeterli olabilir).

17

18

19 A. tumefaciens ile bitkilere gen aktarımı
A. tumefaciens transgenik bitkilerin üretiminde kullanılan en yaygın araç olma özelliğini halen korumaktadır. Bu bakteri aracılığıyla her çeşit bitki hücresine gen aktarmak mümkün iken, gen aktarılan hücre oranı son derece düşüktür. Bu nedenle, çok sayıda gen aktarımı yapılmayan hücre içerisinden gen aktarımı yapılan hücrelerin belirlenerek seçilmesi gerekmektedir. Gen aktarımının başarısını en fazla etkileyen faktör ise gen aktarımı yapılan hücrelerin rejenerasyon kabiliyetidir.

20 A. tumefaciens ile bitkilere gen aktarımı
Ancak, bitki dokularındaki hücrelerin son derece az bir bölümü hem gen aktarımı hem de rejenerasyon yeteneğine sahiptirler. Bundan dolayı, tarımsal öneme sahip olan genleri bitkilere aktarabilmek için, bitki doku ve hücrelerinden etkili rejenerasyon yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Agrobacterium aracılığıyla yüksek oranda bir gen aktarımı için gerekli olan koşulları şu şekilde sıralamak mümkündür;

21 Gen aktarımı için gerekli olan koşullar
Gen aktarımı için uygun gelişme safhasındaki eksplant devamlı olarak sağlanmalıdır. Tür içerisindeki farklı çeşitlerde başarılı olmalıdır. Geliştirilen gen aktarım tekniği, kültürü yapılan yüksek verimli çeşitlerde başarılı olmadıkça hiç bir önemi yoktur. Çok sayıda bireysel transgenik bitki elde edebilmek için yöntem etkili, ekonomik ve tekrarlanabilir olmalıdır. Gen aktarımı yapılan hücrelerden transgenik bitkilerin elde edilebilmesi için etkili bir seleksiyon sistemi geliştirilmelidir. Maliyet ve somaklonal varyasyonu en düşük seviyede tutmak için, doku kültüründe geçen süre mümkün olduğu kadar kısaltılmalıdır.

22 Gen aktarımı için gerekli olan koşullar
Gerek tohumla, gerekse vejatatif çoğaltım için stabil ve üniform transgenik bitkiler elde edilmelidir. Sadece istenilen özellikleri kodlayan genler bitkilere aktarılmalı, istenmeyen DNA dizilerinin geçişi engellenmelidir. Fazla kopya sayısından kaynaklanan, aktarılan genin inaktivasyonunu ve entegrasyon bölgelerinde oluşabilecek gen zararlarını engellemek için, genler düşük kopya sayısında aktarılmalıdır. Aktarılan genler istenilen fizyolojik devrede ve arzu edilen seviyede aktivite göstermelidir.

23 Agrobacterium ile gen aktarımını etkileyen faktörler
Bitki genotipi, Asetosiringon gibi vir genlerini uyarıcı bileşikler, Şekerler ve pH, Sıcaklık ve ışık, Hücre konsantrasyonu, İnokulasyon ve ko-kültüvasyon süresi, Eksplant tipi, Hormon uygulması, Yaralama gibi faktörler

24 Agrobacterium ile gen aktarımında kullanılan eksplantlar
Yaprak, Gövde, Hipokotil, Embriyo, Kök, Çiçek dokuları), Protoplastlar, Hücre süspansiyonları, Kallus dokuları

25

26

27

28