DNA İZOLASYONU VE SAFLAŞTIRILMASI

... konulu sunumlar: "DNA İZOLASYONU VE SAFLAŞTIRILMASI"— Sunum transkripti:

1 DNA İZOLASYONU VE SAFLAŞTIRILMASI

2 DNA DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir
DNA’nın fonksiyonuna bağlı olarak regülatör proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler), DNA ve RNA polimerazlar, DNA ligazlar, kombinasyon ve onarımla ilgili diğer enzimler ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur Virüslerde bir protein kılıf içinde yer alır.

3 DNA’nın İzolasyonu Hücre duvarının parçalanması
DNA-protein kompleksinin çözülmesi (denatürasyon veya proteoliz) DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması

4 Hücre Duvarının Parçalanması
İlk aşama duvarın zayıflatılmasıdır Fiziksel olarak (dondurma-çözme) ya da kimyasal maddeler (lizozim, EDTA vb) uygulayarak yapılır. Tam parçalama işleminde ise iyonik (SDS) veya iyonik olmayan (Triton-100) deterjanlar kullanılır Parçalama işleminde izlenecek yöntem DNA boyutuna ve kullanılan organizmaya bağlıdır

5 DNA’nın Ortamdaki Diğer Moleküllerden Ayrılması
Genom DNA’sı açık halkasal bir yapı göstermesine karşılık plasmid DNA’sı süper sarmal yapıdadır (covalently closed circular (ccc) DNA) Yüksek bazik ortamda (pH ) farklı reaksiyon verir DNA’nın diğer moleküllerden ayrılması için DNA kimyasal ve fiziksel etkilere maruz bırakılır DNA kimyasal olarak (etanol, izopropanol) çöktürülebilir Fiziksel uygulamada santrifüjleme hızı ayrılması istenen molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir

6 DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi
Denatürasyona dayanan bu yöntemde çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır Fenolle proteinler ve DNA fragmentleri denatüre edilerek ortamdan uzaklaştırılmaları sağlanır

7 DNA’nın Saflaştırılması
Ortamda doğrusal ve süper sarmal yapı gösteren DNA’lar mevcutsa bunların ayrılması içerdikleri etidyum bromür (EB) miktarına bağlıdır. Etidyum bromür DNA’ya bazlar arasına girerek bağlanır ve çift sarmalın çözülmesine neden olur. Bu durum doğrusal DNA molekülünün boyunun uzamasına ve plasmidlerde süper sarmal dönümlerin oluşmasına neden olur. Süper sarmal dönümlerin yoğunluğundaki artışla EB girişi engellenir. Doğrusal DNA molekülü doygunluğa erişinceye kadar EB almaya devam eder EB değişik oranda bağlanması sonucu oluşan yoğunluk farkı bu iki molekülün farklı çökelmesine neden olur DNA’nın saflaştırılması için CsCl-etidyum bromür gradienti denge santrifüjlemesi kullanılır

8 Sezyum klorid derecelenme santrifüjlemesi
Ayırmak istenilen molekül santrifüjlenerek belirli yoğunluktaki sezyum klorid içerisine konur Bir gün süresince santrifüj yapıldığında en altta çok yoğun, üstte ise daha az yoğun sezyum klorid konsantrasyonu derecelenmesi görülür Kromozomal DNA izole edildikten sonra içinde plasmid DNA olduğu ihtimali düşünülerek santrifüj işlemi uygulanırsa plasmid DNA daha az yoğunluktaki sezyum kloridde bulunur Karışımlar kendi yoğunluklarına yakın olan konsantrasyonlarda sıralanırlar Ayrıca kromatografik yöntemlerden hidroksiapatit kromatografisi ile ileri derecede DNA’yı saflaştırmak mümkündür.

9 Prokaryotik DNA İzolasyonu
Bakterinin kromozomal DNA’sı Ekstra kromozomal DNA’nın izolasyonu (plasmid, bakteriyofaj)yapılabilir

10 Kromozomal (Genomik) DNA İzolasyonu
İlk aşama bakteri hücre duvarının zayıflatılması Dondurup çözme gibi fiziksel yöntemler ve enzim kullanımına dayalı kimyasal yöntemler Uygun pH ve iyon konsantrasyonları, ultrasonikasyon, dondurup-çözme, blendır gibi yöntemler kullanılır Hücre lizisinden sonra RNA’yı parçalamak için RNaz, proteinleri parçalamak için proteazlar kullanılır Geride kalan proteinleri ve oligopeptidleri parçalamak için fenol veya fenol kloroformun eşit miktardaki karşımı kullanılır DNA bulunan faza alkol ilave edildiğinde yüksek molekül ağırlıklı DNA beyaz ipliksi bir yapı halinde çöker Geride kalan tuz, deterjan gibi safsızlıkların uzaklaştırılması için diyaliz uygulanabilir

11 Ekstrakromozomal DNA İzolasyonu
Kromozomal DNA’nın uzaklaştırılması hedeflenir Bakteriyofaj DNA’sının izolasyonunda infekte bakteriden faj partiküllerinin saflaştırılmasıyla kromozomal DNA’dan arınılmış olunur. Proteaz ve fenol muamelesi ile bakteriyofaj DNA’sı serbest kalır Daha sonraki saflaştırmalar kromozomal DNA’daki gibidir

12 Plasmid DNA İzolasyonu
Kromozomal DNA uygulamalarına benzerlik gösterir Aradaki farklılık kromozomal ve plasmid DNA’larının konfegurasyon bakımından farklı oluşları ile ilgilidir Plasmid DNA’sı halkasal ve süpersarmal bir yapıdadır Yüksek pH, sıcaklık koşullarında denatürasyon ve daha sonra renatürasyon görülür Denatüre edilmiş DNA solüsyonu nötralize edilir veya soğutulursa lineer DNA’da (kromozomal DNA) komplementer zincir tek iplikli iken, süpersarmal DNA’da tek iplikli karışımlar birbirlerine sarılı durumdadırlar. Alkali-lizis ya da yüksek sıcaklık gibi koşullarda denatürasyondan sonra plasmid DNA’sı pH nötralleştiğinde daha kısa sürede renatüre olur. Bu nedenle plasmid DNA’sı kromozomal DNA’dan kolaylıkla ayrılır

13 Ökaryotik DNA İzolasyonu
Ökaryotik hücrelerden DNA’yı izole etmek prokaryotlara göre daha zordur (Nükleus zarı, organellerde DNA bulunur) Tüm hücre (total) DNA’sı izole edilmek isteniyorsa lizis işlemine benzerlik gösteren bir yöntem kullanılabilir Hücre zarı önce dikkatli bir şekilde lizize uğratılarak nükleus ve organellerin zarları parçalanmamış biçimde elde edilir. Boyut, yoğunluk ve çeşitli deterjanlara duyarlılık açısından nükleus, mitokondri ve kloroplast farklılık gösterdiklerinden kolaylıkla ayrılabilirler. Bu organeller lizise uğratıldıktan sonra DNA, RNA proteinlerden arındırılır. Mitokondri ve kloroplast DNA’ları genellikle bir ölçüde kapalı halkasal karışımlar halinde bulunurlar ve plasmid DNA’sının izolasyonuna benzer şekilde izole edilirler

14 DNA Konsantrasyonu ve Saflığının Kontrolü
Nükleotidlerin heterosiklik halkalarının 260 nm dalga boyundaki ışığı maksimum emme derecesi nükleik asitlerin miktarının bir ölçüsüdür. DNA’nın miktar ve saflığı spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilecek değerlerden belirlenir. 1 optik dansite (OD)= 50 µg/ml (çift iplikli DNA) 1A 260= 40 µg/ml (tek zincirli DNA/RNA) Oligonükleotidler için 20 µg/ml’ye karşılık gelmektedir. Proteinler UV’yi 280 nm’de maksimum düzeyde absorblar Nükleik asitlerin saflığı 260 ve 280 nm’deki değerler arasındaki oranla belirlenir A260/A280= (saf DNA) Eğer ortamda fenol veya protein bulunuyorsa oran bu değerlerden düşük olacaktır. Çift iplikli DNA miktarı (µg/ml) = 260 nm’deki OD x katsayı (50) x sulandırma oranı

15 RNA İzolasyonu Hücrenin diğer karışımları ile kontamine olmamış yani biyolojik olarak aktif ve yıkılmamış RNA’ların saflaştırılması demektir (mRNA çabuk yıkılır) RNA saflaştırılmasında en önemli zorluklardan biri endojen RNaz’ların RNA’ları parçalamasıdır. Bu nedenle izolasyon sırasında çeşitli RNase inhibitörleri kullanılmalıdır Bu amaçla EDTA, EGTA (kelatörler), SDS (deterjan), guanidyum izotiyosiyonat gibi kuvvetli denatüre edici ajanlar kullanılmalıdır RNA izolasyonunda kullanılacak cam madde %0.02’lik DEPC (dietilpirokarbonat) ile mutlaka yıkanmalıdır (RNase inhibisyonu için) Steril çalışmaya çok önem verilmelidir İzole edilen RNA’nın saklama koşulu deterjan varlığında veya etanolde -20 ve -80 gibi düşük sıcaklıklardır

16 Organizma grubuna göre kullanılan maddeler değişmekle birlikte öncelikle hücre lizisi ortak bir özelliktir Proteinlerin uzaklaştırılması için bir hacim fenol kloroform eklenir. Santrifüjleme ile oluşan çökelti ile proteinler uzaklaştırılır. 0.2 M NaOAc (sodyum asetat) ile etanol karıştırılarak santrifüjleme sonunda total nükleik asitler elde edilir 3M NaOAc (pH=6) ilave edilir ve 2-3 saat soğukta bekletildikten sonra santrifüj yapılır. Sıvı fazda olan DNA RNA’dan ayrılır RNA ise NaOAc ve etanol ile elde edilen pellette bulunur Tüpteki örnek kurutulur, uygun çözücü veya deiyonize su ile çözüldükten sonra -20 oC’de saklanabilir. Özellikle polisakkaritler gibi kontaminantların uzaklaştırıması için CsCl2 derecelenme santrifüjlemesi (16 h rpm) kullanılır.

17 Saflığını kontrol etmek için spektral olarak ölçüm yapılır
Saflığını kontrol etmek için spektral olarak ölçüm yapılır. A260/A280=2 ise RNA çok saftır. Total RNA karışımından mRNA izole etmek istenirse mRNA’nın 3ı ucundaki poliA kuyruğundan yararlanılır. PoliA mRNA’yı taşınma sırasında enzimlerden korur ve hareketini sağlar mRNA kromatografik olarak ayrılabilir Oligo(dT) selüloz veya poli U sefaroz kullanılarak yapılan kromatografi ile mRNA’nın poliA kuyruğu yüksek tuz konsantrasyonunda kolona bağlanarak diğer RNA türlerinden ayrılır. Bağlı mRNA’nın kolondan ayrılması ise düşük tuz konsantrasyonları ile gerçekleştirilir