PRATİK DERS NOTU. Enterobacteriaceae familyası esas olarak insan ve hayvanların kolonunda bulunan gram negatif basillerin yaptığı geniş bir aile olup.

... konulu sunumlar: "PRATİK DERS NOTU. Enterobacteriaceae familyası esas olarak insan ve hayvanların kolonunda bulunan gram negatif basillerin yaptığı geniş bir aile olup."— Sunum transkripti:

1 PRATİK DERS NOTU

2 Enterobacteriaceae familyası esas olarak insan ve hayvanların kolonunda bulunan gram negatif basillerin yaptığı geniş bir aile olup birçoğu kolon normal florasında bulunur. Bu grupta yaklaşık 40 cins ve 140 tür bakteri bulunmaktadır.

3 Grup içinde E. coli, Salmonella’lar, Proteus türleri gibi sık karşılaşılan bakterilerin yanısıra Budvicia, Cedecea, Lechercia ve Tatumella gibi nadir rastlanan bakterilerde bulunmaktadır. Enterik bakterilerin genel özellikleri şunlardır.

4 Yaklaşık 0.3-0,5 mikrometre en, 1-6 mikrometre boyunda, genelde hareketli, bazısı hareketsiz, düz, Gram negatif, çomak biçiminde bakterilerdir.

5 Fakültatif anaeropturlar, genel kullanım besiyerlerinde kolay ürerler. Fermentatif metabolizmaları var olup tümü glukozu parçalayıp asit ve bazıları asit+gaz oluştururlar. Diğer şekerlere etkileri değişkendir. Katalaz olumludur. Nitratları nitritlere indirgerler. Hiçbirisinde sitokrom oksidaz bulunmaz, Oksidaz negatiftir.

6 Enterobacteriacea familyasındaki tüm bakteriler gram negatif basil oldukları için Gram boyama ile ayırt edilemezler. Gram boyamada gram negatif basiller görülür. Bu nedenle çeşitli özelliklere dayanılarak konur.

7 Koloni morfolojisi, pigment oluşumu, hareket özelliği, Laktoz fermentasyonu, enzimatik aktivite, asit oluşumu, H 2 S oluşumu ve diğer biyokimyasal testler tanıda kullanılır..

8 Enterobacteriaceae’ların İdantifikasyonu : 4 basamakta gerçekleşir. 1. basamak: Gelen klinik örnekler 1-2 besiyerine ekim yapılır (zenginleştirilmiş özellik gösteren ve ayırtedici olmayan kanlı agar ve orta derecede ayırdedici özellik gösteren EMB yada Mc Concey besiyerlerinden birine ekim yapılır.

9 2. basamak: Oluşan koloniler incelenir. Laktozu parçalayan bakteriler, laktozu parçalamayanlara göre EMB ve Mc Concey agarda farklı renkte koloniler oluştururlar.

10 Laktozu parçalayan bakteriler Mc Conkey ve Endo agarda kırmızı renkli koloniler oluştururken EMB de genellikle mor, parlak ( metalik röfle veren) koloniler oluştururlar. Laktozu parçalamayan bakteriler ise bu besiyerlerinde renksiz koloniler oluştururlar.

11 3. Basamak: Oksidaz Deneyi: Kullanılan ayıraç “dimetil ya da tetrametil para fenilen diamin dihidroklorid” tir. Ayıraç besiyerinde üremiş koloniler üzerine damlatılır. Oksidaz (+) de koloniler mor mavi siyah renk verir. Koloni renginde değişme yoksa oksidaz (-) kabul edilir.

12 Yada oksidaz ayracı kurutma kağıdı üzerine dökülür ve besiyerindeki kolonilerden alınan bakteri örnekleri kurutma kağıdı üzerine sürülür. Koloniden alınan bakterilerin sürüldüğü kağıt kısmının rengi 15-30 saniye içinde mor pembe renk alırsa oksidaz pozitif olarak kabul edilir. Enterik bakterilerde oksidaz negatiftir.

13 4. Basamak: Kolonilerden alınan örneklerle bakterilerin biyokimyasal özellikleri incelenir.

14 Sık kullanılan biyokimyasal testler sıklıkla laktoza, sukroza, glikoza etki; glikozdan gaz oluşturma, İndol deneyi, metil kırmızısı deneyi, Voges–Proskauer deneyi, sitrat utilizasyonu, üreaz oluşturma ve diğer şekerlere etkileri gibi deneylerdir.

15 Enterik bakterilerin izolasyonunda sık kullanılan besiyerleri ve içerikleri:

16 a.EMB: (Eozin Metilen Blue) besiyeri: Pepton, laktoz,sukroz, agar, eozin Y, metilen mavisi, saf su: Karıştırılıp 121 C 15 dk. da steril edilir. Plaklara dökülür. İçerdiği eozin Y, metilen mavisi gibi boyalar Gram (+), bakterilerin üremesini engeller. Ayırt edici bir besiyeridir. Laktozu fermente eden bakteriler madeni parlaklık veren koloniler oluşturabilirler. Laktozu fermente etmeyenler saydam renksiz kolaniler oluştururlar.

17 b. Mc Concey agar : Pepton, laktoz, NaCl, agar, saf su, safra tuzları, kristal viyole ve nötral kırmızısı karıştırılır otoklavda steril edilir, plaklara dağıtılır. Besiyerinde bulunan kristal viyole ve safra tuzları Gram (+) bakterilerin üremesini engeller. İçerdiği laktoz nedeniyle laktoza etki eden ve etmeyen bakterilerin ayırt edilmesinde kullanılırlar.

18 Laktoza etki eden bakteriler oluşturdukları asidin nötral kırmızısına etkisi ile pembe kırmızı renk koloni oluştururlar. Laktoza etki etmeyen salmonella, shigella gibi bakteriler renksiz ya da sarı renkli koloniler oluştururlar.

19 . Selenit F buyyonu: Karışık floralı örneklerden salmonella ve shigella’ların çoğalmalarını sağlayarak izole edilmelerini kolaylaştıran bir besiyeridir. Besiyerinde bulunan selenit tuzları enterokokların ve normal dışkı flora üyelerinin üremesini baskılar. İçerisinde Salmonella olduğu düşünülen dışkı örnekleri bu besiyerine ekilir ve 24 saat sonra aktarma ekimleri yapılır.

20 BiYOKİMYASAL AYIRAÇ BESİYERLERİ TSI :Üç şekerli demirli besiyeri: Gram (-) bakterilerin glukoz, laktoz ve sukroz üzerindeki etkilerine ve H 2 S ve gaz oluşturup oluşturmadıklarını anlamamızı sağlayan bir besiyeridir.

21 Besiyeri içeriği: Pepton, laktoz, sukroz, dekstroz, NaCl, ferric amonyum sulfat, Na tiosulfat, agar, phenol kırmızısı ve saf su. Maddeler karıştırılır.Tüplere dağıtılır ve otoklavda steril edilir.Tüpler dipte 2,5 –3 cm.lik bir dip kısım ve üstünde bir yatık kısım şekilde yatık olarak katılaştırılır.

22 Ekim yöntemi: Kuşkulu bakteri kolonilerine dokundurulan iğne öze ile alınan materyel,önce iğne ile besiyerine dik kısmına batırılması sonra yatık kısmının yüzeyinde zik zak çizilerek ekim yapılır. Ekimler 37  C da 18-24 saat inkübe edilir.

23 Sonuçların Okunması Ve Değerlendirilmesi: Besiyerinde glikozun 10 katı kadar laktoz ve sukroz bulunmaktadır. Glikozu fermente eden bakteriler oluşturdukları asit ile fenol kırmızısı ayıracını etkileyerek sarı renk yaparlar. Bakteriler dipteki glukozu fermentasyonla parçaladıklarından dipte daha fazla asit oluştururlar.

24 Diğer yandan bakteriler besiyerindeki peptonun oksidatif dekarboksilasyonundan alkali ürünler oluştururlar. Bu alkalli ürünler besiyerinin yatık kısmındaki glukozdan oluşan asitleri nötralize ettikleri halde, dipteki yoğun asidi nötralize edemezler. Bu nedenle; Glikoz ve laktoz fermentasyonuyla ilgili olarak TSI de oluşabilecek etkiler aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.

25 Dip sarı+ yatık sarıTSI ye ekilen bakteri Glikoz ve laktozu fermente etmiştir. Dip sarı+ yatık kırmızı Glikozu fermente etmiş, laktozu etmemiştir. Dip kırmızı+yatık kırmızı Glikozu da laktozu da fermente etmemiştir. (nonfermentatif bakteriler )

26 TSI de enterik bakterilerin 4 özelliği değerlendirilir 1. Glikozdan asit +- 2. glikozdan gaz+- 3. laktoz fermentasyonu 4. H 2 S +-

27 Glikoz, laktoz ve sukrozu fermente eden bakteriler bol miktarda asit oluşturduklarından oluşan alkali ürünler ne dipteki ne de yatıktaki asiti nötralize etmeye yetmezler. Bunlar hem dipte hem de yatıkta asit ortam oluştururlar ve tüm besiyeri sarı renk görülür.

28 Fermentasyon sırasında gaz oluşması; besiyerinin içinde gaz kabarcıklarının yada besiyerinin parçalanmasının görülmesi ile anlaşılır.

29 Thiosülfatın üzerine etki ederek H2S oluşturan bakteriler H2S’nin ferric amonyum sulfat üzerine etkisi ile siyah renkli ferröz sülfit yaparlar. Besiyerinin dip kısmının siyahlanması bakterinin H 2 S oluşturduğu anlamını taşır. Thiosülfat üzerine etki ancak asidik ortamda gerçekleşir. Yani H 2 S pozitif ise o bakteri glikozu fermente etmiş demektir.

30

31 İndol Deneyi: kullanılan besiyeri triptofanlı buyyondur. Bakteride triptofanaz enzimi varsa besiyerinde bulunan triptofanı parçalar ve indol halkası açığa çıkar. Bu halkayı görülebilir hale getirmek için Kovaks yada Erlich ayıracı kullanılır.

32 Kovaks ayracının içerisinde amil yada izoamil alkol, para dimetilen amino benzaldehit ve HCl içerir. Erlich ayıracı ise etil alkol, para dimetilen amiobenzaldehit ve HCl içerir. Besiyerinin üzerine birkaç damla bu ayıraçlardan birinden döktüğümüzde besiyeri üzerinde kırmızı halka oluşursa indol pozitif, sarı halka oluşursa indol negatif olarak değerlendirilir.

33 Metil Red (Metil kırmızısı) ve Voges Proskauer deneyleri: Clark Lubs besiyerini içeriği: (glikozlu fosfatlı pepton buyyonu) Peptone5 gr Dipotasyum hidrojen fosfat5 gr Saf su1 lt. Karıştırılır. Otoklavda steril edilir. Bu karışının üzerine 50 ml %10 luk glikoz solüsyonundan ekleyiniz ve daha sonra 5 er ml olarak tüplere dağıtınız.

34 Metil Red içeriği Metil kırmızısı 0.1 gr. Etanol 300 ml.

35 Metil kırmızısını etanol içinde eritiniz ve üzerine 200 ml. Su saf su dökünüz. Bakterilerin glikozu fermente etmeleri esnasında oluşan laktik asit, asetik asit ve formik asit gibi ürünlerden besiyerinin pH sının metil kırmızısı ayıracı ile saptanabilecek derecede düşürmeleri temeline dayanır. Metil kırmızısı ayıracı pH 4.4 ve daha altında kırmız, pH 6.0 ve üstü pH larda sarı renk verir.

36 Metil kırımızısı deneyi: Saf kültürden Clark-Lups besiyerine ekim yapılır. 37  C da 48 saat inkübe edilir. Kültür içerisine 5-6 damla ayıraç damlatılır. MR pozitif ise besiyeri rengi kırmızı olur. Turuncu ve sarı renkler olumsuz sayılır.

37 VP( Voges Proskauer) Deneyi= Asetoin üretimi deneyi Glikozun fermentatif parçalanması esnasında oluşan pürivik asit, bazı bakterilerde bulunan enzimatik sistemlerle daha ileriye doğru parçalanarak son ürün olarak asetoin (asetil metil karbinol) oluşturulur. Özel ayıraçlarla ortaya çıkarılan bu ürünü oluşturan bakteriler VP pozitif kabul edilir.

38 Clark Lups besiyerine ekim yapılan bakteriler 37  C da 48 saat inkübe edilir. Sonra kültür süspansiyonun üzerine önce 0.6 ml. Alfa naphtol ve sonra da 0.2 ml. KOH eklenir. 2-5 dk bekletilir. Bu süre sonunda pembe rengin oluşması bakterilerin asetil metil karbinol (asetoin) oluşturdukları anlamını taşır. Maximum 30 dakika içinde tüp kırmızı pembe renk olmazsa sonuç negatif olarak değerlendirilir.

39 VP ayıraçları: Alfa naphtol (%5 lik solusyonundan 3 ml. ) KOH (%40 lık solusyonundan 1 ml.)

40 Citrat: (Simon’s Citrat) Bakterilerin sitratı tek karbon kaynağı olarak kullanıp kullanmadığını incelemeye yarar. Besiyerinin içeriğinde Na citrat, NaCl, Brom timol mavisi, agar ve saf su vardır. Bakteri sitratı tek karbon kaynağı olarak kullanıyorsa besiyeri rengi alkali ortamda bromtimol mavisi renginden prusya mavisi rengine döner.

41 Citrat besiyerinin rengi; yeşil ise Sitrat testi negatif Mavi ise Sitrat pozitif olarak değerlendirilir.

42 Üreaz deneyi Kullanılan besiyeri üreli buyyondur. Besiyerinin içeriğinde üre, glikoz, pepon maya özütü, fenol kırmızısı ve saf su vardır. Ürenin bakteri tarafından parçalanması sonucunda amonyak ve CO2 oluşur. Ve besiyeri ortamı alkalileşir. Besiyerinin rengi ; Sarı, ıhlamur renginde ise üreaz testi negatif Mor, menekşe ise pozitif olarak değerlendirilir.

43 Hareket besiyeri: Besiyeri içerisinde sığır eti özütü, NaCl, agar ve saf su vardır. Besiyeri yarı katı bir besiyeridir. Yani normal besiyerinde 15gr/L agar bulunmakta iken hareket besiyerindeki agar miktarı 4 gr/L dir. Besiyerine ekim iğne özeyle batırma ekimi yapılır 18-24 saat 37  C de bekletilir.ve besiyerinde ekim hakkının sağ ve soluna doğru yayılma görülmesi pozitif olarak değerlendirilir.

44 Mannitol Besiyeri: besiyerinin içeriğinde pepton NaCl, mannitol, fenol kırmızısı, agar ve saf su vardır. Mannnitolu fermente den bakteriler besiyerinde asidik ortam oluşturur. Bu asidik ortam fenol kırmızısına etki ederek besiyerinin rengini sarı renge dönüştürür. Besiyerinin kırmızı renk olarak kalması: Mannit negatif, sarı renge dönüşmesi mannit pozitif olarak değerlendirilir.

45 ONPG (ortho nitrophenil – Beta D Galaktosidaz) deneyi: Bir mikroorganizmanın laktozu parçalayabilmesi için iki enzime gereksinimi vardır. Bu enzimler 1. Permeaz, 2. Beta galaktozidaz. Bazı enterik bakterilerde permeaz enzimi olmadığı halde beta galaktozidaz enzemi olabilir.

46 ONPG testi bir mikroorganizmanın beta galaktozidaz enzimine sahip olup olmadığını ortaya çıkarır. Serum fizyolojik içeren bir tüpe plak besiyerinde üremiş olan bakteri örneğinden özeyle alınır. Süspanse edilir. Bu süspansiyonun üzerine bir damla toluen eklenerek iyice karıştırılır. Bu işlemle bakteri hücresindeki beta galaktozidaz hücre dışına çıkar.

47 Daha sonra süspansiyona 0.2 ml ONPG eriyiği damlatılır. 35  C lik su banyosunda enkube edilir. Bir saat sonra sarı rengin oluşması pozitif olarak değerlendirilir. Negatif çıkanlar 35  C de bir gece bekletilerek tekrar değerlendirilir.

48 Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan diğer testler: Lizin dekarboksilaz, Arginin dekarboksilaz, ornitin dekarboksilaz, eskülin hidrolizi, gliserol fermentasyon vb. gibi testlerde tanıda kullanılır. Enterik bakterilerin izolasyonunda kullanılan diğer besiyerleri: Salmonella Shigella agar, hektoen enterik agar, ksiloz lizin dekarboksilaz agar. Özellikle dışkı örneklerinden Salmonella ve Shigella izole etmek için tercih edilen besiyerleridir.

49