Genel Biyoloji Laboratuvarı II Dersi

... konulu sunumlar: "Genel Biyoloji Laboratuvarı II Dersi"— Sunum transkripti:

1 Genel Biyoloji Laboratuvarı II Dersi
Konu: DNA İzolasyonu Hazırlayan: Arş. Gör. Ayşenur YAZICI Erzurum Teknik Üniversitesi Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı, 2018

2 Nükleik Asit İzolasyonu ve Analizi
Hücrede iki tip nükleik asit bulunur. 1) DNA 2) RNA DNA hücre içerisinde, çeşitli katyonlar, poliaminler, ve proteinlerle etkileşim içinde ve sıkı bir şekilde paketlenmiş halde bulunur. Şekil 2: DNA’nın diğer moleküllerle etkileşim halinde olduğunun gösterimi Şekil 1: DNA’nın primer yapısının gösterimi

3 DNA izolasyonunda hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın 3 aşama mutlaka bulunmalıdır.
Hücrenin Parçalanması ve DNA’nın açığa çıkması DNA-Protein Kompleksinin ayrılması DNA’nın kimyasal yöntemlerle RNA ve Diğer makromoleküllerden ayrılması Şekil 3: DNA İzolasyonunun Şematik Hali

4 DNA izolasyonunda bilinmesi gereken önemli Bilgiler
Genomik DNA izolasyon methodu, mitokondri DNA’sı izolasyon methodu, Kloroplast DNA’sı izolasyon Methodu, Bitki, Bakteri, fungus, Kan, Plasmid DNA’ları izolasyon Methodları birbirinden farklıdır. Sizce Neden Farklılık vardır?

5 (Bu kimyasallar tüm meslek hayatınızda karşınıza çıkacaktır.)
2) DNA izolasyonunda kullanılan kimyasalların özellikleri bilinmelidir. (Bu kimyasallar tüm meslek hayatınızda karşınıza çıkacaktır.) SDS = Sodium dodecyl sulfate: Hücre membranının lipopolisakkarit kısımlarını suda çözünür hale getirip, uzaklaştırır. Anyonik bir deterjandır. EDTA = 2,2',2'',2'''-(Ethane-1,2-diyldinitrilo)tetraacetic acid: Dnase aktivitesini durdurur. Mg+2 iyonları için şelatör görevi yapar. (İngilizcesi: cheating agent) Etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesinde kullanılır.

6 CTAP : Genellikle bitki hücrelerinden DNA izolasyonunda kullanılır
CTAP : Genellikle bitki hücrelerinden DNA izolasyonunda kullanılır. Katyonik bir deterjandır. Lipid moleküllerine bağlanarak membran yapısını bozar. Karbonhidratların parçalanmasını sağlar. Fenol-Kloroform: Kloroform Fenol ile birleştirildiğinde proteinlerin denatürasyonunu sağlar. Tuzlar (NaCl): proteinlerin birleşerek çökelti oluşturmasını sağlarlar. (İngilizcesi: Salting-out of Proteins) Proteazlar: Proteazlar özellikle DNase ve diğer proteinlerin enzimatik olarak yıkılmasını sağlarlar. Proteinaz K en çok kullanılan enzimdir.

7 Şekil 4: Fenol ekstraksiyonu gösterimi
Isoamyl alcohol: Köpüklenmeyi engelleyerek, protein çökeltisinin orta fazda stabil kalmasını sağlar. Fenol:kloroform:izoamilalkol oranı: 25:24:1’dir. Şekil 4: Fenol ekstraksiyonu gösterimi

8 Deney adı: Buğday rüşeyminden DNA izolasyonu
Not: Yukarıdaki kimyasalları kullanarak DNA izolasyonunu yapabiliriz. Peki elimizdeki imkanlarla DNA izolasyonu yapabilir miyiz? Etrafımızda bulunan maddeleri laboratuvar maddelerine nasıl dönüştürürüz? Materyaller: Buğday rüşeym kısmı, buğdayın en tepesinde embriyo olarak adlandırılan, tohumun üremesini ve çimlenmesini sağlayan kısımdır. Sıcak su Bulaşık deterjanı Etil alkol veya İzopropanol

9 Deneyin yapılışı: 1 gram Buğday rüşeymi tartılır.
50’lik falkon tüpüne alınır. 20 ml °C’lik su eklenir. 3 dk boyunca karıştırılır. 1 ml bulaşık deterjanı ekleyerek 5 dk süresince her dakika başında invert-spin yapınız. (Not: invert-spin: alt üst ederek karıştırma) Yavaşça 15 ml %90 lık isopropil yada etil alkol eklenir. Alkol eklendikten sonra yaklaşık 15 dk beklenir. DNA boncuklar şeklinde üst yüze toplanır. Pastör pipeti ile toplanır. -20 derecede saklanır. (DNA saklama koşulu -20 derecedir.)

10 Nasıl bir görüntü göreceksiniz?