Sunuyu indir
Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz
1
Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 9 Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi
Prof. Dr. Hilal Özdağ A.Ü Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Tel: /125 Eposta:
2
Gen İfadesi DNA Transkripsiyon RNA Translasyon PROTEİN
3
Prokaryotik Hücre Nükleoid Bölge Kapsül Flagellum Ribozom
Besin Granülü Flagellum Plazmid DNA Sitoplazma Plazma membranı Hücre duvarı Kapsül
4
Gen İfadesi 20. yy’ın başından beri organizmaların metabolizmalarının nasıl düzenlediğine dair araştırmalar sürmektedir. Sınırlı bilgi ve teknolojinin varlığında başlayan bu araştırmalarda bakteriler en baştan beri (ve bugüne kadar) en iyi model organizmalar olmuştur. Gen ifadesine dair veriler öncelikle biyokimyasal analizlerden elde edilmiştir.
5
Gen İfadesi 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.
6
Gen İfadesi Araştırmalar en önemli sonuçlarını 1946’da Jacques Monod’nun çalışmaları ile vermeye başlıyor. Ardından Joshua Lederberg, François Jacob ve Andre L’woff’un katkıları sürecin deşifre edilmesinde önemli rol oynuyor. Bu araştırmalarla şekillenen operon modelinde aynı süreçte beraber çalışan çalışan enzimleri kodlayan genler (poli sistronik) kümeler halinde organize olur.
7
Gen İfadesi Bu genler tek bir düzenleyici birim tarafından koordine edilir. Bu düzenleyici bölge düzenledikleri genlerin üst kısımlarında yer alır (cis-acting bölge). Bu bölgenin regülatör işlevi bu bölgeye bağlanan moleküllerin etkisi (trans-acting elements) ile devreye girer.
8
Operon
9
Operon
10
Operon
11
Gen İfadesi 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.
12
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
Biyokimyasal bulgular Haritalama çalışmaları Mutant suşların oluşturulması ve fonksiyonel sonuçların irdelenmesi Sahte uyarıcıların bulunuşu (laktozun kükürtlü analoğu izopropiltiyogalaktozit_IPTG) ile substrat olmaksızın uyarılma mekanizmasının çalışılmasını sağlamıştır.
13
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
Regülatör bölgeler tanımlanırken yine mutantlardan ve haritalamadan yararlanılmıştır. Laktoz ortamda olmasa da enzimlerin sentezlenmesine yol açan mutasyonların bulunduğu bölgelerin (lacI-) yapısal genlerin yakınında ancak farklı bir bölgede olduğu tanımlanmıştır. lacI geni baskılayıcı gen olarak adlandırılır.
14
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
Benzer etki gösteren diğer konstitütif mutasyonların yine yapısal genlerin hemen yakınındaki operatör bölgede yer aldığı tespit edilmiştir (lacOc). E. coli hücresinde 10 kopyadan fazla bulunmayan baskılayıcı molekülün izolasyonu kolay olmamıştır. 1966’da Gilbert ve Müller-Hill bu molekülü kısmen saflaştırmış ve dansite gradient çalışması ile DNA’ya bağlandığını da göstermişlerdir. 1996 yılında Lewis, Lu ve ark, baskılayıcı komplekslerin kristal yapılarını açıklayarak operon modelini yapısal olarak doğrulamışlardır.
15
Lac Operonu wikimedia.org Yüksek ve konstitütif ifade
Düşük glukoz Laktoz + Yüksek Laktoz - Düşük bazal seviyede ifade wikimedia.org
16
Lac Operonu
17
Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi
18
Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi TA Klonlama
lacZ geni içinde çoklu klonlama bölgesi ve antibiyotik direnç geni içeren plazmid + PCR Ürünü Plazmidin ligasyon sonrası bakteri hücresine transformasyonu
19
Triptofan Operonu
20
Triptofan Operonu
21
Triptofan Operonu
Benzer bir sunumlar
