Türkiye’de Yayılış Gösteren Bazı Achillea L

... konulu sunumlar: "Türkiye’de Yayılış Gösteren Bazı Achillea L"— Sunum transkripti:

1 Türkiye’de Yayılış Gösteren Bazı Achillea L
Türkiye’de Yayılış Gösteren Bazı Achillea L. (Anthemideae, Asteraceae) Taksonlarının Moleküler Karakterizasyonu Harun Baltaş, Efkan Bağda Cumhuriyet Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Merkez, Sivas e-posta: GİRİŞ Asteraceae familyasının en son evrimleşmiş cinslerinden biri olan Achillea L. (1, 2) Dünya üzerinde geniş yayılıma sahip 140 kadar tür içermektedir Tüm Dünya’ya yayılmış halde yaklaşık 140 türle temsil edilen. Bunlardan 48 tanesi Türkiye’de yayılış göstermekte olup bilenen toplam türün 1/3’ünden fazlasına karşılık gelmektedir. 48 türün 23’ü endemik olup, 16 endemik türe sahip Santolinoideae seksiyonunun gen ve değişim merkezinin Anadolu olduğu düşünülmektedir (1, 3, 4, 5,). Türkiye Achillea türlerinin ve endemiklerin en çok Anadolu Çaprazı’nda (B5, B6, B7, C5) yoğunlaştığı bilinmektedir (1). Sivas ve çevresinin de içinde bulunduğu, bu bölge cinsin Anadolu’da evriminde önemli bir yer tutar. Hibrit ve poliploidi sıklığından dolayı kompleks filetik yapı görülen bu cinsin filogenetik ilişkilerinin belirlenmesi problemlidir (6, 7) Arabacı (2006) tarafından morfolojik özelliklere dayalı revizyonu yapılan ülkemiz Achillea cinsi populasyonlarının moleküler verilere dayalı kapsamlı bir sistematik çalışması bulunmamaktadır. Bu çalışma ile çekirdek ITS DNA dizi verileri kullanılarak Türkiye’de yayılış gösteren toplam 18 Achillea türüne ait populasyonların (11 endemik) genetik yapıları ve filogenetik akrabalık ilişkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. MATERYAL ve METOD Çalışma için 18 Achillea türüne ait 89 lokaliteden örnekleme yapılmıştır (Şekil 2, Tablo 1). Anadolu Çaprazının cinsin türleşmesinde önemli bir etkisi olduğu düşüncesinden hareketle Anadolu Çaprazı'nın farklı bölgelerinden populasyonlar çalışma için kullanılmıştır. Örnekler, Cumhuriyet Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Erol Dönmez tarafından adlandırılmış olup, herbaryum numaraları verilerek, Cumhuriyet Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryum'u (CÜFH) için herbaryum örnekleri ve DNA örnekleri olmak üzere iki şekilde çalışılmıştır. Total Genomik DNA İzolasyonu Total genomik DNA, eşit miktarda doku örneklerinden Doyle ve Doyle (1987) tarafından tanımlanan CTAB prosedürü modifiye edilerek izole edildi ve 260 nm'de absorbansı ölçüldü, %0.8'lik agaroz jelde kalitesi belirlendi nrITS Bölgelerinin PCR ile Çoğaltılması nrITS bölgesi (ITS-1, 5.8S geni ve ITS-2) için;“ITS-4” (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) ve “ITS-5” (5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′) (9) oligonükleotidleri kullanıldı. 50-μL PCR ortamı için 10–50 ng genomik DNA, 1× PCR tamponu, 1.5–2.5 mM MgCl2, 0.2 mM herbir dNTP’den, U Taq polimeraz ve 20 pmol herbir primerden, % 0.4 DMSO (dimetil sülfoksid), kullanılarak, başlangıç denatürasyonu 3 dk 94°; 35 döngü boyunca;1 dk 94°C, 30 sn-1 dk 45-52°C, 1 dk 74°C ve 10 dk 72°C final uzama sıcaklık profili uygulandı. PCR ürünleri % 1’lik agaroz jele yüklenerek kontrol edildi. PCR ürünü gen bölgeleri, ya direkt PCR ortamından, ya da agaroz jelde yürütülerek ve jelden saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılarak, hizmet alımı ile iki yönl dizileme yaptırılmıştır. DNA dizi analiz sonuçları ise MEGA 5.0 (10) kullanılarak görüntülenecektir. DNA dizi verileri, ClustalX (11) çoklu dizi hizalama programı ile hizalancaktır. Çalışılan örneklere ait veriler, literatür verileri ile birleştirilerek analizler yapılarak cinse ait populasyonların genetik yapıları ile filogenetik akrabalık ilişkileri araştırıldı. Achilleus populasyonlarının filogenileri komşu-bağlama (NJ), maksimum olasılık (ML) (MEGA 5.0) ve Bayesiyan (MrBayes 3.1.2) çıkarsamalı olmak üzere gerçekleştirildi (10, 12, 13). Analizler sonucunda inşa edilen gen ağaçları FigTree v1.3.1 (14) programı kullanılarak çizildi. Bayesiyan çıkarsamalı ve Markov Chain Monte Carlo (MCMC) temelli filogenetik analizler MrBayes (12, 13) programı kullanılarak gerçekleştirildi. Dizi verilerine uygun mutasyon modeli Mega 5 programı tarafından belirlendi. 106 jenerasyon sayısı için her biri dört zincirli (3 ısıtılmış ve 1 soğuk zincir) iki bağımsız yürütme 2 tekrarlı gerçekleştirildi ve ağaçlar her 1000 döngüde bir örneklendi. Durağan dağılım üzerine konvergens, ayrılma frekanslarının ortalama standart sapması iki bağımsız yürütme arasında 0.05 değerinin altında olup olmadığı kontrol edilerek doğrulandı. Bayesiyan posterior olasılıkları son 750 örneklenen ağaç arasından (Örneklemelerin %25 yani 250 örneklem ön deneme yani burn-in olarak uzaklaştırılarak) Çoğunluk-Kuralı Konsensus Ağacı (Majority-Rule Consensus Tree) oluşturuldu. Şekil 1. Örnek lokaliteleri. SONUÇ Toplamda 18 türe ait 89 populasyondan 367 Achillea örneğinden DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). Şimdiye kadar sadece A. coarctata (Kayseri) ve A. wilhelmsii (Sivas) örneklerinden çift bant görüntülenmiş ancak ITS dizilemesi yapılamamıştır (Şekil 2). Çalışmalar devam etmekle birlikte elde edilen ilk verilerle Guo ve ark.’na (2004) ait ITS verileriyle birlikte analizinde önemli bulgulara ulaşılmıştır. Yeterli bootstrap değerlerine sahip olmadığından NJ, ML ve UPGMA ağaçları gösterilmemiş olmakla birlikte genel ağaç topolojisinde major farklılıklar belirlenmemiştir. BI ile oluşturulmuş konsensus ağacının yüksek bootstrap değerlerine sahip olduğu görülmüştür (Şekil 3). Achillea cinsi monofiletik olup, bazı türlerin parafiletik dağılım gösterdiği belirlenmiştir. Otanthus maritimus türünün üç farklı seksiyondan türlerle birlikte iç grup içinde (büyük dal uzunluğuna sahip) yerleşmesi parafiletik görüntüyü güçlendirmektedir. Ağaç topolojisi Ptarmica seksiyonu ile birlikte atasal grup olarak belirlenen Santolinoideae seksiyonuna ait yüksek tür sayısı ve endemizm oranı ile karakterize Anadolu’nun bu yönüyle Achillea cinsi için önemli gen ve/veya orijin merkezi olduğu fikrini desteklemektedir (6). Önemli bir diğer bulgu ise UPGMA ağacında A. coarctata türünün tüm diğer türlere dış grup olarak konumlanmasıdır. Diğer tüm analizlerde bu türle ilgili diğer ilgi çekici bulgu ise sahip olduğu yüksek genetik farklılıktır. Bu durumun daha fazla örnekle çalışarak netleştirilmesi amaçlanmaktadır. Şekil 2. ITS PCR ürünleri agaroz jel görüntüleri (aynı bireyler iki defa yüklenmiştir). Teşekkür:Bu çalışma Cumhuriyet Ünv. Bilimsel Araştırma Projeleri Başkanlığınca desteklenmektedir (F-413). KAYNAKLAR 1. Arabacı T. ;2006. Türkiye’de yetişen Achillea L. (Asteraceae) cinsinin revizyonu, Doktora Tezi. İnönü Üni. Fen Bilimleri Enstitüsü, Malatya. 2. Rahimmalek, M.; Tabatabaei, B. E. S., Arzani, A. and Etemadi, N.; Assessment of genetic diversity among and within Achillea species using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Biochemical Systematics and Ecology 37, 354–361. 3. Ehrendorfer, F. & Guo, Y.-P. 2006: Multidisciplinary studies on Achillea sensu lato (Compositae-Anthemideae): new data on systematics and phylogeography. Willdenowia 36: 4. Çelik, N. ve Akpulat, A.; Achillea sivasica (Asteraceae: sect. Babounya (DC.) O. Hoffm.), a new species from Inner Anatolia, Turkey. Kew Bulletin, 63 (3), 5. Arabacı T., Budak Ü.; Achillea hamzaoglui (Asteraceae), a new species from Turkey. Annales Botanici Fennici, 46: 6. Guo Y. P., Ehrendorfer F. and Samuel R.; Phylogeny and systematics of Achille (Asteraceae-Anthemideae) inferre from nrITS and plastid trnL-F DNA sequences, Taxon, 53:3 p 7. Guo, Y. P., Wang, S.-Z., Vogl, C. and Ehrendorfer F.; Nuclear and Plastid Haplotypes Sugget Rapid Diploid and Plyploid Speciation in the N Hemisphere Achillea millefolium Complex (Asteraceae). BMC Evolutionary Biology, 12, 2. 8. Doyle, J.J. and Doyle, J.L.; A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phyto. Bull. 19: 11–15. 9. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J., White, T. (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, 315–322. 10. Tamura, K., Peterson D., Peterson N., vd.; MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Likelihood, Distance, and Parsimony methods. Molecular Biology and Evolution. 11. Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I.M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G., Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947–2948. 12.Huelsenbeck, J.P., Ronquist, F.; Mrbayes: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics, 17, 754–755. 13. Ronquist, F., Huelsenbeck, J.P.; MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19, 1572–1574. 13. Rambaut A.; FigTree v1.3.1 Available from: < FigTree/>. Şekil 3. BI konsensus ağacı (kırmızı dal:Achillea, yeşil dal: Santolinoideae, siyah dal: Anthemideae, mavi dal: Ptarmica, mor dal: Babounya, sarı dal: dış grup)