In vitro DNA AMPLİFİKASYONU PCR POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU

... konulu sunumlar: "In vitro DNA AMPLİFİKASYONU PCR POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU"— Sunum transkripti:

1 In vitro DNA AMPLİFİKASYONU PCR POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU

2 1953 1866 1957 1963 1972 1966 1980s 1990s 2000 DNA nın kimyasal yapısı
.Bitkilerde kalıtımın esasları 1957 1963 Sanger :sekans prosüdürü. Kornberg: test tüpünde DNA. 1972 Berg:ilk recombinat DNA molekülü. 1966 Genetik kod ilk konvansiyonel DNA bazlı deneyler 1980s PCR 1990s 2000 İlk gen tedavileri insan genomunun sekanslanması Genetik gıda mühendisliği ‘Dolly’

3 PCR 1985 yılında bilim dünyasına sunulmasıyla birlikte yeni bir çığır açmıştır

4 ABD'de Cetus şirketin'de çalisan Henry A
ABD'de Cetus şirketin'de çalisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiş ve K.Mullis’ a, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülü verilmiş. Kary Mullis c1983

5 PCR PCR, DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi in vitro koşullarda amplifiye etmek için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. PCR uygulamaları için ilgili gen bölgesine ait baz dizisinin bilinmesi gereklidir. Yöntem basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır.

6 PCR Reaksiyonu? Denatürasyon (90-95 °C) Primer bağlanması (50-70 °C)
Üç temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürün miktarı, bu üç adımın tekrarına bağlı. Denatürasyon (90-95 °C) Primer bağlanması (50-70 °C) DNA sentezi (70-75 °C) Bu üç adım bir PCR siklüsünü oluşturur

7 PCR REAKSİYONU DNA 106-1012 arasında çoğaltılır
Denatürasyon : DNA nın iki zincirinin yüksek ısı ile birbirinden ayrılması Hibridizasyon : Sentetik oligonükleotidlerin (primer) hedef DNA ya bağlanması Polimerizasyon :Zincirin uzaması ve belirli sayıda tekrarlanmasıdır. DNA arasında çoğaltılır

8 Her Bir Isı Döngüsünde Oluşan Kopya Sayısı
Döngü Sayı 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64

9 PCR için 1) DNA örneği, genelde genomik DNA, 2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer, 3) dNTP'ler (A,T,C,G), 4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi, 5) Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı gereklidir.

10 PCR da kullanılan malzemeler
Kalıp DNA Taq Polimeraz (x 0,25 µl) Reaction buffer (x 2,5 µl) forward primer (x 0,5 µl) reverse primer (x 0,5 µl) dNTP (x 4 µl) MgCl2 (x 2,5 µl)

11 Kalıp DNA Genomik, plazmid, faj DNAsı,herhangi bir DNA parçası
Tek ve çift zincirli DNA Klonlanmış bir DNA parçası için nanogram, genomik DNA için mikrogram düzeyindeki miktarlar kullanılır Sirküler DNA ise lineer hale getirilmeli Uygun DNA miktarı için seri konsantrasyonlar denenmeli

12 Polimeraz En yaygın Thermus aquaticus dan elde edilen Taq DNA polimeraz dır. Taq DNA polimeraz optimal uzama sırasında yani °C arasında 2000 nükleotid/dakika hızında çalışır Bir DNA iplikçiğini kalıp olarak kullanır ve deoksiribonükleotitlerin polimerizasyonunu katalizler. Bir holoenzimdirler ve doğru işlev yapabilmek için Mg a gerek duyar. Mg iyonunun yokluğunda apoenzim formundadır. RNA polimerazdan farklı olarak, sentezi başlatmak için primer gerek duyar. Primerin serbest 3’ OH ucuna dNTP lerin fosfodiester bağlarını kataliz ederek sentezin 5’---3’ yönünde ilerlemesini sağlar Eksonükleaz aktivitesi vardır. Yani hatalı eşleşen nükleotitleri tanır ve tamir ederler.

13 Primerler Hedef gen ya da DNA nın tekrar tekrar replikasyonu ile büyük miktarda elde edilmesini sağlarlar. Tek dallı olan oligonükleotid primerler, denaturasyonla tek-dallı hale getiren iki DNA parçası ile komplementer olarak birleşir. Yeni sentezlenen DNA, orijinal DNA nın tamamen aynısı olup diğer siklusta kalıp görevi görür ve primerlerle yeniden birleşebilir. Yüksek konsantrasyonda olmaları halinde; ektopik noktalara yapışma olabilir ve istenen hedef DNA dışında bölgelerde çoğalmaya başlar. Eğer yeterli konsantrasyonda değilse; PCR ürünü çok az olur

14 Uygun Primer Seçimi Ve Dizaynı
Uzunluğu bp arasında, özgün ve iki primer aralığı bç olmalı 3'ucunda G.C olmalı      Pürin : pirimidin içeriği 1 : 1 civarında olmalı (%40-60 olabilir). Primer dizileri; istenilen DNA dizisi ve genomda başka gen bölgeleri ile benzerliği varmı? Primerın kendisine veya antisense primere komplementer olmamalı Her iki primerin Tm arasındaki sıcaklık farkı 5oC‟den fazla olmamalı (Erime sıcaklığı (Tm): Primerin DNA’ya %50 hibridize olduğu sıcaklık ) Eğer iki gen bölgesi çok benziyor ise ( örneğin across türler); amplifiye olan gen bölgesinin 3’ ucuna spesifik olan primer en az 1-2 baz fazla olacak şekilde dizayn edilmeli. Döngü şartları ve tampon konsantrasyonları her primer çifti için ayarlanmalı Primerın molar miktari nükleotid sayısının 0,33 ng ile çarpılmasıyla saptanır Örnek: 1 pikomol 24 bazlık oligodeoksinükleotid ne kadar nanogramdır? (0,33 x 24= 7,92 ng)

15 dNTP (dATP,dCTP,dTTP,dGTP)
Yüksek saflıkta ya tek tek yada dörtlü karışım halinde 100μM dNTP konsantrasyon uygun olmakla birlikte en uygun konsantrasyon deneysel olarak belirlenir. Yüksek dNTP konsantrasyonu hata oranını arttırır, düşük dNTP ve Mg konsantrasyonu hata oranını azaltır.

16 Tamponlar Standart PCR tamponu; 50 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (oda ısısında pH 8.3), 1.5 mM MgCl2 dür. 72°C'de inkübe edildiğinde pH yaklaşık 7.2'ye düşer. Bivalent katyonların ortamdaki varoluşu önemlidir. DNA 10 mM Tris.Cl (pH 7.6); 0.1 mM EDTA (pH 8.0) içinde çözülmelidir.

17 MgCl2 Mg, dNTP lerle çözünebilir kompleksler oluşturur, polimeraz aktivitesini sitümüle eder ve çift zincirli DNA nın Tm değerini arttırır ayrıca primer / kalıp etkileşimini sağlar. O yüzden MgCl ‘ün PCR özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde etkilidir. Genellikle MgCl konsantrasyonu mM’ lık değerler tercih edilir Tampon MgCl içeriyorsa ayrıca ayrıca MgCl kullanmaya gerek yoktur Tm değeri: Çift zincirli nükleik a. molekülündeki baz çiftlerinin yarısının ortadan kalkmasına yol açan sıcaklık.

18 Meltıng Temperature Tm (erime ısısı) hesaplanması
18 nükleotid'den daha kısa oligonükleotidler için Tm hesaplanması. Her A ve T için 2°C; her G ve C için 4°C - bunların toplanması Tm'i verir. Ancak bu uzun oligonükleotidler için uygun olmaz. O zaman Fritsch'in formülü kullanılabilir Tm= (Log10 [Na+] (% G+C)-(600/N)      (N: zincir uzunlugu)

19 Mg Konsantrasyonunun etkilediği olaylar
1. Primer Yapışması 2. PCR ürünü ve template'lerin birleşip ayrılmasına 3. PCR ürününün spesifitesine 4. Primer-dimer artefaktların oluşmasına 5. Taq polimeraz enzim aktivitesine (Taq-polimerazın çalışabilmesi için serbest Mg olması gereklidir.)

20 PCR ı etkileyen olaylar
Reaksiyon pH’sının önemi Reaksiyon pH'sı düşürüldüğünde; Taq polimerazın hata oranı azalır. pH 8.2'ye doğru çıktıkça hata oranı artar. Her üç ünitlik pH değişikliğinde; nokta mutasyonu hata oranı 60 kat; Frameshift hata oranı ise 11 kat artış gösterir

21 PCR ı etkileyen olaylar Siklus Sayısı
25-30 siklus yeterli siklus sayısı arttıkça hata oranı da artar Örnegin hata oranı 20 siklusda 1/10.000, 50 siklusda 2.5 x 10-3 veya 1/400 nükleotid düzeyine çıkar. Siklus sayısı arttırıldıkça DNA Polimeraz miktarı ↓. Amplifikasyon 37°C'de çok daha iyi olmasına karşın; yanlış bağlanma (mispriming) artar. 50°C'de ise mispriming azalır, spesifite artar ama PCR ürün miktarı daha azdır. Uzama için her kb için 1 dk'lik süre yeterlidir.

22 PCR ı etkileyen olaylar Isı
DNA'nın yüksek ısı ve düşük pH'da inkübasyonu ile DNA hasarı ve mutasyon olasılığı ↑ . En sık görülen DNA hasarı sitozinin urasil oluşturacak şekilde deaminasyonudur (Camino grubu kaybedilince U haline gelir. U eğer düzeltilmezse bir sonraki döngüde A ile eŞleseceği için (CG →TA) seklinde değişir) Urasil, timin ile aynı kodlama potansiyeline sahip olduğundan transition (geçis) mutasyonuna yol açar

23 DNA hasarı ayrıca: N-glikositik bağların hidrolizi ile bazların serbest kalmasıyla oluşur.
Bu hidrolitik reaksiyon yüksek ısıda ve düşük pH'da artar. DNA'nın depürinasyonu (A veya G kaybedilip rasgele bir bazla değişmesi) pH 7.4 ve 70°C'de yaklaşık 4x10-9/sn oranında oluşur. Depirimidinasyon ise 20 kez daha yavaştır (2x10-10/sn ve 80°C). Pirimidin salınımı, 95°C'ye doğru ısı arttıkça ↑. Benzer olarak depürinasyon, ısı arttıkça artış gösterir. pH'nin düşürülmesi ile de spontan pürin kayıp oranı ↑

24 PCR'da sitozin deaminasyonunun oluşma riski; en çok denatürasyon basamağında olur.
Sitozinin deaminasyonunun oranı tek iplikçi DNA'da 80°C'de 1x10-8/sn; 95°C'de 2x10-7sn‘ dir.

25 PCR’da her adım farklı sıcaklıklarda gerçekleşir
Denatürasyon: C Hibridizasyon: C Polimerizasyon: 72 C

26 PCR PCR adımları Denatürasyon
DNA yeni zincir sentezine hazırlanmak için ayrılır (94-950C)

27 Denatürasyon DNA yeni zincir sentezine hazırlanmak için ayrılır (94-950C)

28 Annealing Uygun sıcaklıklarda primerler hedef bölgelerle birleşir

29 Extension Polimeraz enzimi aracılığıyla primerlerin ssDNA kalıplarına bağlanarak zincirin 5’ den 3’ ne uzamasıdır Taq polimeraz C 2000 nukleotid/dakika hızla uzatır Siklus azaldıkça hız azalır Multiplex PCR da enzim tutunması ve nükleotidleri bularak bağlanması zaman alır o yüzden süre 2 dk kadar uzatılır

30

31 Z a m a n 30x Sıcaklık Ayrılma 94 oC Çoğalma Primer bağlanması 72 oC
100 50 Z a m a n

32 İlk Birkaç Siklus Primerlerin hedef DNA'da yapışabilecekleri yerleri tarama fazı. Amplifikasyon daha sonra başlar. DNA az ise Tarama fazında primer ile DNA'nın birbirleri ile karşılaşma şansı az ancak primer-primer karşılaşması ve primer dimerlerinin oluşma olasılığı fazladır.

33

34

35

36

37 Pcr Sonuçlarının Değerlendirilmesi
PCR ürünleri uygun moleküler ağırlıkta bir marker ile birlikte Ethidium bromide ile boyanarak agarose gel de elektroforez işlemine tabi tutulur. UV transimulatör ile bantlar gözlenir. Ayrıca Poliakrilamide gel elektroforez (PAGE) metodu da kullanılabilir.

38 Pcr Sonuçlarının Değerlendirilmesi

39 Ürinlerin değerlendirilmesi
Thermal Cycler Elektroforez 3-4 hours Ürinlerin değerlendirilmesi (Agaroz jel) UV translüminatör 39

40 PCR Yapılırken Laboratuarda Dikkat Edilmesi Gerekenler
Kontaminasyon riskini ortadan kaldırmak için "laminar flow hood" kullanılmalı. Eldiven kullanılmalı. Sarf malzemeleri küçük hacimlerde saklamalı. Sarf malzemelerini taşıyan mikrotüp açılmadan santrifüjlenmeli. DNA eklenirken; hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edilmeli Deneyde bir pozitif kontrol bir de DNA dışında tüm PCR komponentlerini taşıyan negatif kontrol olmalı.

41 PCR optimize ederken… Optimize edilmesi gerekenler:
Konsantrasyonlar

MgCl2 konsantrasyonu
Primer ve kalıp DNA konsantrasyonu
Fazla kalıp PCR’ı engelleyebilir. Kalıp gerekiyorsa seyreltilip kullanılmalıdır.
Termal döngü sartları
Bağlanma ısısı
Primer çiftinin Tm derecesine göre ayarlanır.
Uzama süreleri
Amplikonun uzunluğu dikkate alınır.

42 PCR Destek Kuvvetler… DMSO %2-10 Fazlası Taq aktivitesini düsürür. Kalıp DNA’nın olusturduğu ikincil yapıları çözer. Özellikle GC oranı yüksek hedef bölgelerin çoğaltılması için kullanılabilir.
Betain M DMSO ile aynı amaçla kullanılabilir.
Formamid %1-5 Mümkün olduğunca az kullanılmalı. Đkincil yapıların önlenmesinde kullanılabilir.
Non iyonik deterjanlar (Tween 20-NonIdet P40- TritonX) .
%0.1-1 arası kullanılabilir. %0.1 Taq’ı stabilize eder ancak özgün olmayan amplifikasyonu tesvik edebilir. %0.5 kullanımı daha garantilidir. BSA (bovine serum albumin) Eski DNA materyellerinden yapılan amplifikasyonlarında kullanılabilir. PCR inhibitörlerinin etkisini azaltır.

43 Bant yoksa Reaksiyona koymanı gereken bütün reaktifleri ilave ettiniz mi?
Lab defterinizi kontrol edin.
Reaksiyonu tekrarlayın.
Reaktiflerin konsantrasyonları doğru mu?
Kalıp
Primer
Taq
MgCl2
Hatalı primerler
Dizileri kontrol edin.
Yeni sentez veya yeni tasarım deneyin. Kötü kalıp
Agaroz jelde kalıp DNA’yı kontrol edin. DNA fazla degrade olabilir.
Kalıp DNA PCR inhibitörü içeriyor olabilir (fazla tuz, fenol gibi).
Optimal olmayan PCR sartları
Bağlanma ısısını düsürün.
MgCl2 konsantrasyonunu arttırın.

44 PCR ürünü zayıf ise Bağlanma ısısı kademeli olarak ↓ Bağlanma süresi ↑
Primer ve DNA miktarı ↑ Taq DNA polimeraz ↑ Her ürün 100 bp den küçükse KCl konsantrasyonu ↑

45 Oldukça uzun beklenmeyen ürünler varsa
Bağlanma süresi ↓, ısı ↑ Uzama ısısı ve süresi ↓ MgCl sabit tutularak KCl konsantrasyonu 2 kata çıkarılmalı,dNTP konsantrasyonu sabit tutulmalı Daha az primer kullanılmalı Daha az kalıp DNA kullanılmalı Taq DNA miktarı ↓

46 Çok kısa beklenmedik ürünler varsa
Bağlanma ısısı ve süresi ↑ Uzama süresi uzatılır Uzama ısısı C Primer ve DNA miktarı ↓ DNA polimeraz miktarı ↓ Bağlanma ısısını ↑ MgCl2 konsantrasyonu↓ Termal döngü kosullarını değistirin
Döngü sayısını ↓
Farklı primerler deneyin

47 Reaksiyon önceden çalıştığı halde sonradan çalışmamaya başlarsa
Reaksiyon tüpüne konan madddelerin miktarları kontrol edilemeli dNTP ler (dondurma ve çözmeye duyarlı oldukları için ) yeniden hazırlanmalı Primer miktarı ↑ Bağlanma ısısı 6-8 derece düşürülerek tekrar çalışılmalı Kalıp DNA miktarı ↑

48 PCR İnhibisyonu Ortamda RNA düzeyi yüksek olduğunda RNase eklenirse ürün miktarı ↑ Yüksek konsantrasyonda EDTA’nın Mg'u bağlaması Ortamda heparinin ve fenol bulunması,. Urasil konsantrasyonunun yüksek olması Uzun süre UV ışığa maruz kalan "mineral oil“ ün kullanılması PCR komponentlerinin konulduğu tüplerin yapısı

49 Pcr Kullanım Alanları 1.Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastanın tanısı, 2. Prenatal tanıda, 3. Patojen organizmaların saptanması, 4. Adli tıpta, 5. Onkogenesis de, 6. Klonlama, gen expresyon araştırmalarında, 7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında, 8. Bilinmeyen dizilerin tayininde, 9. Geçmis DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında, 10. RFLP Analizinde, 11. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında, 12. DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında .

50 PCR Çeşitleri Touchdown PCR Hot start PCR Multipleks PCR Nested PCR Kısmi Nested PCR Koloni PCR Arbitrary PCR Revers Transkriptaz PCR Real-Time PCR

51 Touch Down Pcr PCR spesifikliğini arttırmak için geliştirilmiştir.
Optimizasyon, annealing ısısı üzerine odaklanarak gerçekleştirilir. Tek bir siklus programının seyri süresince yapışma dereceleri ardışık olarak değişecek şekilde düzenlenir ilk sikluslarda annealing ısısı 650C den 550C ye her iki siklusta bir indirilir. Son 10 siklus ise 55 0 C de gerçekleşir.

52 Hot start PCR Çok az miktardaki DNA örneklerinin çoğaltılmasında kullanılır. Bu teknikte (tag polimeraz ) reaksiyon ortamına denaturasyon aşamasında sonra ilave edilir. Özgül olmayan bağlanmalar engellenir

53 İn situ PCR PCR ile in situ hibridizasyonu birleştiren bir tekniktir.
Lam üzerine tespit edilen enfekte hücrede bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNA veya RNA amplifikasyonunu ve hücre tipi tutulumunu belirlemede kulanılabilir

54 Asimetrik PCR Primerlerden birisinin konsantrasyonu diğerine göre azaltılır. Böylece amplifikasyon bir yöne doğru ilerler. Bu metot SSC tekniğine ve DNA dizi analizine hazırlık olarak yapılır Tek iplikli DNA’nın amplifikasyonu da mümkün.

55 Nested PCR İki aşamalıdır.
Önce bir çift primer kullanılarak uzunca bir bölge amplifiye edilir Daha amplifikasyon ürününün kısa bir bölümü diğer bir primer çifti ile çoğaltılır Bu yöntem düşük kaliteli ve az miktardaki DNA için kullanılır. PCR ürünü ikinci PCR da hedef olarak kullanılır

56 Multiplex PCR Çok sayıda primer kullanılarak çok sayıda hedef bölge aynı anda amplifiye edilir. Delesyonların haritalanması, küçük delesyonlar, çerçeve kayması mutasyonları,nokta mutasyonların analizinde kullanılır.

57 Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD)
RAPD nükleotid dizilimi rasgele seçilmiş primerler kullanılarak yapılan PCR dır Nükleotid dizi bilgisine sahip olmaksızın polimorfizimin belirlenmesini sağlar. RAPD’ nin temeli yaklaşık 10 nükleotidlik ve nükleotid dizilimi rasgele seçilmiş tek çeşit primerlerin kullanıma dayanır. Pek çok farklı yapının genotipinin belirlenmesi, genom yapısının araştırılması, çeşitli taksonomik çalışmalar, evrimsel sorunlar, populasyon biyolojisi, bireysel,kültür ve ırk belirlenmesinde, ebeveyn belirleme, genetik varyasyonun belirlenmesi, bağlantı haritalarının oluşturulması, özgün bir gen lokusunun belirlenmesi adli tıp, klinikal teşhis, prenatal tanı, salgınlar ve ekoloji alanlarında

58 RT (Reverse-Transcription) PCR
RNA molekülü PCR ile çoğaltılamadığından PCR aşamasından önce RNA ters transkriptaz (reverse transcriptase) enzimi kullanılarak cDNA (komplementer DNA)’ya çevrilir. Ardından DNA, PCR ile çoğaltılmaktadır. Bu sentezler aşaması RT-PCR olarak adlandırılmaktadır.

59 SSC PCR (single spesifik primer PCR)
Genin bir tarafının baz dizisi biliniyor bir tarafının bilinmiyorsa bu teknik kullanılır. Delesyon ,duplikasyon, insersiyon ve rekombinasyon mutasyonları saptanabilir. Aynı boyuttaki ssDNA yapılarındaki değişikliğe bağlı olarak non-denatüre jelde farklı pozisyonlarda yürürler

60 Real-Time PCR Eş zamanlı olarak izlenen online- PCR