HÜCRE KÜLTÜRÜNE GİRİŞ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE KULLANILAN TEKNİKLER MTT TESTİ

... konulu sunumlar: "HÜCRE KÜLTÜRÜNE GİRİŞ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE KULLANILAN TEKNİKLER MTT TESTİ"— Sunum transkripti:

1 HÜCRE KÜLTÜRÜNE GİRİŞ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE KULLANILAN TEKNİKLER MTT TESTİ
Ar.Gör. Özlem ÖZDEMİR

2 Hücre kültürüne giriş Steril Kültür Koşulları • Ayrı Bir Oda
• Classıı Biyogüvenlik Kabini • Ters Mikroskop • Pipet Seti Steril Hücre Kültürü Ekipmanları • Kültür Kapları • Besiyeri • Serum

3 Kültür Kapları Flask veya petri kapları kullanılır.
Tek kullanımlık, polistrenden üretilmişlerdir ve radyasyon ile sterilize edilmiştir. Yapışık hücreler için işlem görmüş plastik malzeme tercih edilmelidir (Polistren yüzey amino grupları ile kaplanmış olabilir).

4 Besiyeri Hazır olarak satın alınır.
Besiyerleri birbirlerine benzer görüntü olarak. Genellikle pH indikatörü olarak hepsinde fenol kırmızısı bulunur. Sarımsı asidik besiyeri: – Fazla üremiş kültürü – Bakteri kontaminasyonunu – Fazla CO2’i işaret ediyor olabilir. •Morumsu bazik besiyeri: – Ürememiş kültürü – Küf kontaminasyonunu – Az CO2’i işaret ediyor olabili

5 Besiyeri kullanılmadan önce 37oC’ye ısıtılmalıdır
Besiyeri kullanılmadan önce 37oC’ye ısıtılmalıdır. (Su banyosunun içinde yaklaşık 10 dak). Besiyerinin içindeki bazı bileşenler (antibiyotik) uzun süre sıcakta beklemeye dayanıklı değildir.

6 Serum Serumun yüzdesi: %5-20
Serumun tipi: Standart olan bovine serum (dana serumu) dur. Fetal bovine serum( FBS) (fetal dana serumu ) da tercih edilir.

7 Hücre Kültürü Temel Teknikler
Pasajlama 2. Hücre dondurma 3. Hücre çözme

8 Hücre Kültürü Teknikleri Hücre sayımı ve canlılığının belirlenmesi
Hücre canlılığının ve çoğalmasının ölçülmesi birçok in vitro yönteminin temelini oluşturmaktadır. Hücre büyümesinin belirlenmesi geleneksel yöntemlerde canlı hücrelerin boyanmasının ardından sayılmasına dayanmaktadır. Tripan mavisi bunun için kullanılan basit bir yöntemdir fakat bu methodun duyarlılığı düşüktür

9 Hücre sayımı ve canlılığının belirlenmesi MTT TESTİ
Sarı renkli tetrazolium MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) metabolik olarak aktif hücrelerde dehidrogenaz enzimi aktivitesiyle indirgenerek mor renkli formazan oluşturur. Bu renkli bileşenin absorbansı spektrofotometrede ölçülerek analiz edilebilir. ( genellikle nm aralığında)

10 MTT TESTİ Bu redüksiyon sadece mitokondriyal redüktaz enzimler aktif olduğunda gerçekleşmektedir. Dolayısıyla bu dönüşüm canlı hücre sayısıyla doğrudan ilişkilidir.

11 Mor renkli bileşik spektrofotometrede ölçülerek analiz edilebilir.
Canlı hücrelerde mitokondriyal dehidrogenazlar tetrazolium halkasını parçalayarak mor renkli MTT formazan kristallerini oluşturur. Formazan kristalleri sulu çözeltilerde çözünmezler. Mor renkli bileşik spektrofotometrede ölçülerek analiz edilebilir. Hücre sayısındaki artış MTT formazan oluşumda artışa neden olacaktır. Bunun sonucunda da absorbansda artış gözlenecektir.

12 MTT yöntemi Mitogen, Antijenik stimuli, Büyüme faktörleri ve diğer büyümeyi tetikleyici faktörlere karşı hücre büyümesinin ölçülmesinde Sitotoksisite çalışmalarında Hücre büyüme eğrisi çalışmalarında kullanılan oldukça kullanışlı bir yöntemdir.

13 Ancak bu yöntem hücrelerin fizyolojik durumlarından, mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesindeki değişimlerden etkilenmektedir.

14 MTT Protokol Hücreler 96-well plate lere ekilir.
20 ml 5 mg/ml MTT solüsyonu eklenir, iyice karıştırılır. 37 C inkübatörde 4 saat inkübe edilir. Medium dikkatli bir şekilde uzaklaştırılır ve 100 ml DMSO eklenir. 595 nm de spektrofotometrede absorbans ölçülür.

15 MTT Sonucu