Sunuyu indir
Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz
2
Ör. Protein ekspresyon analizi, 3D yapı analizi DNA RNA PROTEİN MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM Nasıl? Neden? Nasıl? Neden? Nasıl? Neden? Gen dizisi transkriptler primer protein ürünleri fonksiyonel proteinler (DNA) (mRNA) Transkripsiyonel kontrol Translasyonel kontrol Translasyon sonrası Kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar) Ör. mRNA analizleri Ör. Metabolik işleyiş, enzim aktivitesi, etkileşimler Nükleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler Moleküler etkileşimler Ör. Nükleotid dizisinin, TNP’lerin belirlenmesi
3
OMİK VERİLER : Bir bilmecenin parçaları !
4
Proteom: Deyimin ilk kullanılışı*: Bir hücre, doku veya organizmada, belli bir zaman aralığında veya belli koşullar altında genom tarafından anlatımı yapılan tüm proteinler PROTEin + genOM *Wilkins ve ark. (1994) : 4th Symposium on "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" in Siena, Italy. Wilkins ve ark. (1996): Biotechnol Genet Eng Rev 13, 19-50.
5
Proteomik : Protein anlatımını ve işlevini genom ölçeğinde araştırmak PROTEin + genOMİK
6
NEDEN PROTEOMİK ? Farklılaşmanın temelinde proteinler var ! Hemen tüm hastalıklar birden çok genle ilişkili ! Hastalıkların bir kısmı normal bir proteinin hatalı modifikasyonundan kaynaklanmakta ! Proteinler tanıda geniş çapta kullanılıyor ! Tedavide kullanılan hemen tüm ilaçların hedefi proteinler...
7
Ayrıca: mRNA profili genin aktif olup olmadığı hakkında bilgi verse de, her zaman tam gerçeği yansıtmayabilir. Çünkü: mRNA hızla proteine dönüştürüldüğü için proteine eşdeğer miktarda bulunmayabilir. Miktarı az olan proteinler bol bulunanlar içinde saptanamayabilir. mRNA’nın ortaya koyacağı protein molekülünün aktivitesi hücrede bulunduğu yere ve/ya geçireceği modifikasyonlara göre değişebilir. İnsan hastalıklarının tanısı için kullanılan bazı örnekler (idrar, beyin-omurilik sıvısı) mRNA içermez. İnsan biyopsi ve otopsi örneklerinde örnek alma ve analiz arasında geçen süre uzadıkça mRNA yıkılır ve doğru sonuç alınamayabilir.
9
Protein Karışımı Ayırım 2D-PAGE Proteinler Spot Kesimi Tripsin ile muamele Peptitler MALDI-TOF ESI-MS/MS Peptit kütle parmakizi Tandem MS Spektrumu Veritabanı Araştırmaları Proteinlerin Tanımlanması ve post translasyonal modifikasyonlar 2D-Jel Temelli Yaklaşım Jel Temelli Olmayan Yaklaşım Protein karışımı Kesim Ayırım 2D- HPLC Peptit Karışımı Protein fraksiyonları Ayırım μHPLC, 2D-LC, AffiniteKromatografisi Tripsin uygulaması Peptitler Peptit fraksiyonları MS-MS LC-MS/MS Tandem MS spektrum Veritabanı araştırmaları Proteinlerin Tanımlanması
11
Proteom analizinde işlem sırası (genel uygulama) 1. basamak: Kompleks karışımların ayrılması Kromatografik Yöntemler Elektroforetik Yöntemler (1-, 2-DE) 2.basamak: Proteinlerin görünür ve işleme açık hale getirilmesi Jel üzerinde saptama (boyama), Membrana aktarıp saptama (Western blotlama), proteolitik kesim 3. basamak: Güçlü analitik tanımlama yöntemlerinin uygulanması (MS’e dayalı yöntemler) 4. basamak: In silico değerlendirme [BİYOİNFORMATİK !!!!] Bilgisayar ortamında birikmiş verilerle karşılaştırma Yeni modeller önerme
12
EN ÇOK KULLANILAN YÖNTEMLER 2-Boyutlu Jel Elektroforezi (2D-GE) 1.boyut: izoelektrik odaklama 2.. Boyut: SDS-PAGE KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (MS)
15
TÜP JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ DİKEY JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ MEMBRANA AKTARIM (EMDİRİM, “Western blotting”) SİSTEMLERİ GÜÇ KAYNAĞI
18
2-DE ve KÜTLE SPEKTROMETRİSİ
19
1 23 4 5 1- Örnek uygulama yeri 2- Örneğin veya bileşenlerinin değişik metotlarla iyonlaştırldığı bölüm 3- Oluşan iyonları manyetik ve/ veya elektrik alanına yönlendirildiği bölüm 4- Elektromanyetik alandan geçen iyonların Kütle/Yük oranının hesaplanması 5- Bu hesaplara dayanarak bileşenlerin biyoinformatikle tanımlanması ve verilerin karşılaştırılması Kütle Spektrometresi (Mass Spectrometer, MS)’nin Kısımları
20
MS’nin Proteomikte kullanılabilir hale gelmesini sağlayan devrimlerin yapıldığı bölümler ESI ve MALDI TOF ve FT-ICR En çok kullanılan yöntem MALDI-TOF
21
Proteomik’te Kullanılan İyon Kaynakları 1.ESI ( Electron Spray Ionization) Elektron püskürtme ile iyonlaşma 2.MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Matrix destekli lazer emilimi iyonlaşması
22
John Bennett Fenn (ABD) Biyolojik makrokomelküllerin yapı analizinde çığır açan ESI-MS yöntemini bulduğu için 2002’de Nobel Ödülüne layık görüldü. Bu alanda çalışmaya 70 yaşında başladı ve 82 yaşında Nobel ödülünü kazandı. ESI yöntemi makromoleküllerin parçalanmadan incelenmesine olanak tanıyan bir yöntemdir, bu yüzden proteinlerin yapı analizinde ve karmaşık farmasötiklerin tanımlanmasında önemli rol oynamaktadır. ESI HİÇBİR ZAMAN HİÇBİR ŞEY İÇİN GEÇ DEĞİL!
23
MALDI yöntemi de ESI yöntemi gibi makromoleküllerin parçalanmadan incelenmesine olanak tanıyan bir İyon Kaynağı içermektedir. Temelde birbirine çok benzeyen bu yöntemlerde en büyük fark MALDI yönteminde daha az sayıda çoklu yük taşıyan ([M + nH] n+ ) iyonların üretilmesidir. Koichi TANAKA Nobel Kimya Ödülü 2002, MALDI yöntemi için MALDI
24
PROTEOMİKTE 2 TEMEL STRATEJİ: 1)“Shotgun Proteomics” (Global protein analizi) 2)“Targeted Proteomics” (Belli bir hedef doğrultusunda sınırları çizilmiş analiz) Belli bir organele, yapıya, sinyal yolağına, protein kompleksine, ailesine vb. odaklanarak yürütülür.
26
KANSERDE KEMO-PROTEOMİK YAKLAŞIM SERENEX Ağız kanserlerinde kemoterapi ve radyoterapinin yan etkilerini azaltan bir ürün geliştirildi: SNX-2112 : HSP-90 İnhibitörü
27
NÖRODEJENERATİF HASTALIKLAR KONTROL ALZHEIMER HASTASI Snap-25: Vezikül etkileşiminde görevli AP: Amilolid protein GF: Glial fibriler asidik protein
29
Çeşitli organellerin içeriği yeni proteomik tekniklerle ortaya konulacak. Biyogöstergelerin saptanmasını kolaylaştıracak veriler çoğalacak. Posttranslasyonel modifikasyonlar hakkındaki bilgi birikimimiz artacak, böylece “SAĞLIKLI” olma koşulu tanımlanacak. Özgül protein-ksenobiyotik bileşimleri tanımlanacak. İmmün sistem aktivasyonu ve ilaçlara/kimyasallara verilen özgül cevapları bulmamız kolaylaşacak. Nanohacimde ve hızlı protein analizleri terapötik hedef keşfinden tanıya ve epidemiyolojik araştırmalara dek geniş ufuklaraçacak.
Benzer bir sunumlar
