In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH)

... konulu sunumlar: "In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH)"— Sunum transkripti:

1 In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH)
Fatma Elif Çepni, Aslıhan Temel, N. Özer Şenol, Barış Eren, Murat Pekmez, Özgür Çakır

2 In situ Hibridizasyon (ISH)
Geçmişi 30 yıldan daha fazlaya dayanan bir yöntemdir, Sitolojik preparatlarda, genlerin veya DNA dizilerinin kromozomlar üzerinde direkt yerleşimine olanak tanır. Son 15 yıl içinde yardımcı floresan tekniklerin gelişmesiyle birlikte, bu tekniğin uygulanmasında bir artış gözlenmiştir. -ISH tekniğinin önemli modifikasyonlarından biri de genomik in situ hibridizasyondur (GISH). -GISH, türler arası hibritlerde, parental genomların ayrılmasına olanak tanıyan genomik boyama tekniğidir

3 Tek bir nukleusla temsil edilen farklı türlerden köken alan kromozomların ayırımına dayanan bir yöntemdir. Somatik hibritlerin mayozu ve geri çaprazlama sonucu elde edilen hibritlerin çalışılmasında kullanılabilir. Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir. Çok sayıda doğal alloploid hibritlerde ve türler arası hibritlerde kullanılmıştır. ÖR: domates-patates (Jacobsen et al. 1996), Allium cepa- A. fistulosum (Khrustaleva and Kik, 1998), Alstroemeria aura- A. inodora (Kamstra et al. 1999)…

4 FISH Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır. Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken, Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomları boyamada fluoresan moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir değerlendirme aracıdır.

5

6 FISH Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon prensibine göre, prob ve örnek arasında melez bir yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir işlemdir. FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur. FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen, tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini görebilmek için hibridizasyona uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob) kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir.

7 FISH Bu yöntem gen haritalanmasında ve kromozom aberasyonlarının tanımlanmasında kullanılır. Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomları), FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır Interfaz genelde kromozomların yeniden düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının belirlenmesinde kullanılır.

8

9 FISH Prob hazırlama Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır. Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar, kromozomların sentromerlerinde bulunan tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır.

10 FISH “Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imakan sağlar FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır

11 FISH Prosedür Metafaz kromozomları veya interfaz nukleusu kullanılarak preparatların hazırlanması Etanol içinde dehidrasyon DNA’yı 70oC’de denatüre etme Etiketli probun denatürasyonu Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat inkübasyon

12 FISH FISH metodunu temel alan bazı uygulamalar geliştirilmiştir
Multicolour-FISH 1. Spectral Karyotyping 2. Multiplex FISH 3. Combined binary ratio FISH (COBRA-FISH) Cross-species colour FISH (R x FISH) Comparative Genomic Hybridisation Kromozom ve locus Spesifik FISH

13 FISH Spektral Karyotipleme M-FISH (Multicolor FISH)
Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların 24 kromozomla hibridizayounu ve tek bir filtreye sahip flüoresans mikroskobu ile analizine dayalıdır. Kansere neden olan genomik değişikliklerin standart bantlama yöntemlerinden daha iyi anlaşılmasını sağlar. M-FISH (Multicolor FISH) 5 florokromun çeşitli kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı flouresans sinyalleri ile analizine dayalı bir yöntemdir.

14 FISH COBRA-FISH R x FISH
Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si diğer gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla hibridleştirilirken, 2. gruba ek olara dördüncü florokrom uygulanır. Bu metod, 5. florokrom için, kollara özgü boyama veya M-FISH ile locus-specific proba geçiş için kullanılmıştır. R x FISH Gibbon kromozomlarının prob olarak kullanılır. Gibbon ve insan kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98 dir. RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça değişimleri değil, aynı zamanda kormozom içi değişimler de belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-bantlama tekniği ile birlikte kullanıldığında 400 kat daha hassas sonuçlar vermektedir.

15 Kanserli bir hücrenin M-FISH ile hazırlanmış idiogramı

16 Spektral Karyotipleme

17 BANTLAMA M-FISH

18

19 FISH Kullanımdaki faydaları Hızlı
Hibridizasyon ve belirleme için yüksek etkinlik Birçok hücre analiz edilebilir Replikasyon geçiren hücrelerin kullanılması gerekmez

20 FISH Kullanımdaki sınırlamalar
Probun uygun olması ve doğru probun eldesi için nelere bakılması gerektiğinin iyi bilinmesi Hibridizasyon için birleşme sinyali Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar

21 GISH(Genomik in situ Hibridizasyon) Temeli

22 CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon)
Genom boyunca DNA dizisindeki kopya saysısı değişimlerini inceleyen bir moleküler sitogenetik teknik Bu teknik, kazanım (duplikasyon, insersiyon veya amplifikasyon) veya net kayıp (materyalde delesyon) gibi kromozom anomalilerinin sınıflandırılmasına olanak sağlar Yöntemin avantajları: Temel avantaj DNA örneklerinin kullanılarak tüm genomun tek bir deneyde görüntülenebilmesi

23 iki renkli görüntüleme sistemi kullanılması sonucunda kromozom anomalilerinin daha güvenilir saptanması Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli olması Test örneği için metafaz kromozomları gerekli değil Katı tümörlerin çalışılmasında da elverişlidir.

24 CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon)

25

26

27