ANALİTİK YÖNTEM VALİDASYONU 7.ders

Enstrümental Yöntemlerin Kalibrasyonu Analitik işlemlerde kalibrasyon ve standardizasyon çok önemlidir. Tüm analitik yöntemler için kalibrasyon gerekir. Yöntemin kalibrasyonu derken bahsedilen şey; ölçülen analitik sinyal ile analit derişimi arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. Çoğu zaman bu ilişki belirlenirken, kimyasal standartlar kullanılır. En çok kullanılan 3 kalibrasyon yöntemi şunlardır: 1- Kalibrasyon grafiği yöntemi 2- Standart ekleme yöntemi 3- İç standart ekleme yöntemi

1- Kalibrasyon Grafiği Yöntemi Kalibrasyon grafiği yönteminde, analit derişimi kesin olarak bilinen birkaç standart çözelti cihaza verilerek cihazın verdiği sinyal ölçülür. Cihazın cevabı, normal olarak şahit (kör) düzeltmesinden sonra kullanılır. İdeal olarak kör çözeltisi, numunenin analit dışındaki tüm bileşenlerini içermelidir. Sonra analit derişimine karşı cihazın düzeltilmiş sinyali (cihaz cevabı) grafiğe geçirilir. Bu eğrilere aynı zamanda, çalışma eğrisi veya analitik eğri adı da verilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin başarısı, standart çözeltilerin ortamının analit çözeltisinin ortamına benzemesine bağlıdır. Ortam hatasını gidermek için ya da azaltmak için girişim yapan maddenin veya analitin ortamdan ayrılması gerekir.

Bilinen analit derişimine karşı sinyal büyüklüğü (absorbans, pik yüksekliği, pik alanı, v.b.) okunarak yapılan kalibrasyon işleminde, veriler grafiğe alınarak, bir kalibrasyon grafiği hazırlanır. Tahmin basamağı denilen ikinci adımda ise, numune için bulunan sinyal şiddetinden, bilinmeyen analit derişimi bulunur. Bu adımda, kalibrasyon grafiği kullanılır. Bulunan analit derişiminden orijinal numunedeki analit derişimi, numune hazırlama basamaklarındaki seyrelmeler göz önüne alınarak hesaplanır. y= 0,0324x + 0,3358 r2= 0,9992

Derişime (c) karşı sinyal şiddeti (R) grafiği Derişime (c) karşı sinyal şiddeti (R) grafiği. Kalibrasyon grafiğinin eğimine, kalibrasyon duyarlığı (m) denir. Gözlenebilme sınırı (DL) ise, belli bir güvenilirlik seviyesinde ölçülebilen en düşük derişimi ifade eder.

Örnek: Bir çözeltide K tayini için aşağıdaki veriler elde edilmiştir Örnek: Bir çözeltide K tayini için aşağıdaki veriler elde edilmiştir. Buna göre çözeltideki K derişimi nedir? Derişim (ppm) 2 4 6 8 Işık Şiddeti 0,2 0,4 0,6 0,8 Bilinmeyen 0,5 5

2- Standart Ekleme Yöntemi Bu yöntemde, belli miktarda numuneye analitin standart çözeltisinden belirli bir hacim eklenerek, numunedeki analit derişimi arttırılır. Eklenmeden önceki ve sonraki sinyaller ölçülüp, bulunan değerler analit derişimi hesaplamada kullanılır. Standart ilave etme yönteminde, sinyalin derişimle doğrusal değiştiği varsayılır. Doğrusal kalibrasyon grafiğinden bilinmeyen çözelti derişimi, eğim (m) ve kesim noktası (b) ile ya da ekstrapolasyonla hesaplanabilir. Belli bir kons. (çalışma) aralığında, genellikle doğrusallık gösteren eğriler elde edilir. Çünkü bunlar doğrusal olmayan kalibrasyon eğrilerine göre daha az hata verir. Ancak bazı durumlarda doğrusal olmayan doğrular da elde edilebilir. Doğru bir ilişki kurabilmek için, daha çok sayıda kalibrasyon verisi bulunması gerektiği de bilinmelidir.

Tayin edilecek maddenin bulunduğu ortama matriks (çözelti bileşimi) denir. Matriksin karmaşık olduğu veya bilinmediği durumlarda standart ekleme metodu kullanılabilir. Standartların matriksi, bilinmeyen matriksi ile aynı olmalıdır. Karmaşık numune matrikslerini standart ile benzetmek zor hatta imkansızdır ve girişim hataları oluşur. Matriks etkisini azaltmak için genellikle girişim yapanların, ölçümden önce analitten ayrılması gerekir. Standart ekleme yönteminde, daha çok girişim yapanlar kullanılır veya hem kalibrasyon hem de standart ekleme yöntemi uygulanıp, eğimler eşit olduğu takdirde kalibrasyona da dönülebilir. Aynı miktarda alınan numuneler üzerine biri hariç, artan miktarlarda standart çözelti konur ve daha sonra bunlar belirli bir hacme seyreltildikten sonra ölçüm yapılır.

İlk numune çözeltisine ilave yapılmaz İlk numune çözeltisine ilave yapılmaz. Bu çözeltilerin cihazla sinyalleri ölçülür. Numune çözeltisi hepsinde bulunduğundan ortam yaklaşık olarak aynıdır. Doğrunun X eksenini kesim noktasından numunedeki analit derişimi bulunur veya hesaplanır. Ortam etkisinin olduğu, genellikle karmaşık numunelerin analizinde Standart Ekleme Yöntemi kullanılır. (Vs)o (Vs)o x Cs= Vx x Cx AT = Anumune+ Astandart (Standart ekleme grafiğinde, AT : toplam absorbans; yani numune ve standardın absorbansları toplamıdır. Aynı madde olduğundan b ve  aynıdır.) AT = bCnumune + bCstandart AT = 0 için , bCnumune= bCstandart , Cnumune= Cstandart

En küçük kareler yöntemi kullanılarak da, m ve b hesaplanabilir. Cihaz cevapları (sinyal) Orantı sabiti S b Toplam hacim Vs Eğim Kesim noktası S’nin Vs’nin fonksiyonu olarak grafiği: Cx; iki değerin oranından (b/m) ve bilinen Cs,Vx ve Vs değerlerinden bulunabilir: 10

Bu eşitliğin çözümünden Cx analit derişimi hesaplanabilir. Bir başka yaklaşım da, grafiği elle çizip ekstrapole etmektir. Orjinde (sıfır) ilave edilen standardın hacmi ile doğrunun x-ekseninin kesim noktasındaki hacim (Vs)o arasındaki fark, numunedeki analit miktarına eşdeğer olan standart hacmidir. Ayrıca x-ekseninin kesim noktası, cihazın sıfır cevabına karşı gelir. Bu durumda şunu yazabiliriz: Bu eşitliğin çözümünden Cx analit derişimi hesaplanabilir. Ya da 11

Örnek olarak; Bulunması gereken gerçek kons.: 15 µg/ml 12

ÖRNEK: Doğal bir su numunesinden Fe+3 tayini için alınan 10’ar mL’lik kısımlar 5 adet 50 mL lik ölçülü balona konmuştur. 11 ppm (mg/lt) Fe+3 içeren çözeltiden sırasıyla 0,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 ml bu balonlara ilave edilmiştir. Sonra her balona SCN- ilave edilerek kırmızı renkli Fe(SCN)+2 kompleksi oluşturulmuştur. Bütün balonlar 50 ml’ye tamamlanmıştır. Çözeltilerin kolorimetrede okunan absorbansı sırasıyla (S) 0,241; 0,437; 0,621; 0,809; 1,009 olarak ölçülmüştür. Su numunesindeki Fe+3 derişimi nedir. 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 -10,0 -5,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 Eklenen mL Standart Çöz. Absorbans b=0,2412 m=0,03820 -1,4 ppm 6,31ml -2,2 -1,1 1,1 2,2 3,3 4,4 ppm standart Çözelti 50 ml de 11 ppm varsa 5 ml de 1,1 ppm vardır. 50 ml de 11 ppm varsa 6,31 ml de 1,4 ppm vardır. Cs= 11 ppm, Vx= 10 ml, Vt= 50 ml, Eklenen standart çözeltinin derişimi hesaplanarak sinyale karşı grafiğe geçirilerek de bilinmeyen grafikten bulunabilir. (Cs.Vs/Vt) 5x11/50=1,1 ppm 10x11/50=2,2 ppm 15x11/50=3,3 ppm 20x11/50= 4,4 ppm Bilinmeyen 1,4 ppm (grafikten 6,31 ml) olarak bulunur. (Ya da 1,4 ppm = Vs.11/50 Vs= 6,31 ml) 13

Grafikteki doğrunun denklemini S=m Grafikteki doğrunun denklemini S=m.Vs+b’den hesaplayarak, m ve b bulunur. Denklem, S = 0,03820.Vs + 0,2412 şeklinde yazılabilir. Değerler aşağıdaki eşitlikte yerine konursa: Bu değerler grafiksel ekstrapolasyonla da elde edilebilir. Ya da ekstrapolasyonla sıfır cevaba karşı gelen reaktif hacmi, 6,31 ml olarak bulunur. Buradan da orijinal çözeltideki analit derişimi aynı miktar bulunur: (Vs)o x Cs= Vx x Cx

İlk çözeltinin absorbansı: A1 = k.cu ÖRNEK: Molibden mavisi yöntemi ile fosfat tayininde tek-nokta standart katma yöntemi kullanılmıştır. 2,00 mL’lik bir idrar numunesi, molibden mavisi reaktifleri ile muamele edilerek 820 nm’de absorbsiyon yapan bir tür elde edilmiş, sonra reaksiyon karışımı 100,00 mL’ye seyreltilmiştir. Buradan alınan 25,00 mL’lik bir kısım (çözelti 1) 0,428 absorbans değeri vermiştir. İkinci bir 25,00 mL’lik kısım üzerine 0,0500 mg fosfat içeren 1,00 mL standart çözelti eklenince (Çözelti 2) absorbans 0,517 okunmuştur. Bu verileri kullanarak ve absorbans/derişim ilişkisini doğrusal ve bir tanık okuması yapıldığını varsayarak, numunedeki fosfat derişimini mg/mL cinsinden bulunuz. İlk çözeltinin absorbansı: A1 = k.cu cu ilk çözeltideki bilinmeyen fosfat derişimini ve k orantı katsayısını gösterir. İkinci çözeltinin absorbansı: A2 = k.Vu.cu / Vt + k.Vs.cs / Vt eşitliği ile verilir.

Vu fosfat derişimi bilinmeyen çözeltinin hacmi (25 mL), Vs ilave edilen standart fosfat çözeltisinin hacmi (1 mL), Vt ilaveden sonra toplam hacim (26 mL) ve cs standart çözeltinin derişimidir (0,0500 mg/mL). İlk eşitlikten k yı hesaplayıp, ikincide yerine koyar, buradan cu yu çekersek; cu = A1.cs.Vs / A2.Vt – A1.Vu = 0,428 x 0,0500 x 1 / 0,517 x 26 – 0,428 x25 cu = 0,00780 mg/mL Bu seyreltilmiş numunenin derişimidir. Orijinal idrar numunesinin derişimini bulmak için, 100 / 2 ile bu değeri çarpmamız gerekir. Fosfat derişimi = 0,00780 x 100 / 2 = 0,390 mg/mL

3-İç Standart Ekleme Yöntemi İç standart (internal standart, IS), bir analizde bilinen bir miktarda, numuneye, şahit (kör) numuneye ve kalibrasyon standartlarına eklenen, kimyasal ve fiziksel bakımdan analite benzer bir maddedir. Bu durumda, analit sinyalini doğrudan kullanmak yerine, analit sinyalinin referans tür sinyaline oranı kullanılır. Çizilen grafikte y eksenine sinyaller oranı ve x eksenine de standartlardaki analit derişimi işaretlenir. IS uygun olarak seçilmişse, hem sistematik hem de rastgele hataların bazıları giderilebilir. Matriks etkileri de giderilebilir. Aynı zamanda, IS hem numunelere hem standartlara eklendiği zaman, tekrarlanabilir sonuç elde etmek de önemlidir. IS nin numune matriksi içinde kesinlikle bulunmadığını da bilmek gerekir. IS olarak genelde çok az rastlanan ve numunede bulunmadığı bilinen maddeler seçilir. Bu maddeler, analit ile aynı yerde sinyal vermemelidir. Ancak kimyasal özellikleriyle analite benzemelidir. IS, numune ve standardın ana bileşeni ise, numuneyi alma gibi yerlerden kaynaklı hatalar da giderilebilir. Spektroskopik ve kromatografik yöntemlerde de sıklıkla iç standart yöntemi kullanılır.

Yöntemde, analitin bilinen derişimlerini içeren çözeltilere ve bilinmeyen analit içeren numuneye aynı miktarda iç standart katılması gerekir. Sonra, analit emisyon hattının şiddeti iç standart hattınınkine oranlanır. Analizlenecek numune içinde iç standart bulunmamalıdır. Numunelere, standartlara ve tanıklara eşit miktarlarda iç standart eklenir. Kalibrasyon grafiği, analit sinyalinin iç standart sinyaline oranının analit derişimi miktarlarına karşı işaretlenerek çizilir.

Aanalit/Aiç standart Aanalit/Aiç standart

Alternatif olarak IS, numune ve standartlarda, konsantrasyonları yeterince büyük ve bütün durumlarda aynı olduğu kabul edilen bir ana bileşen olabilir. Bu durumda kalibrasyon grafiği, analit sinyalinin IS sinyaline oranı olarak grafiğe geçirilir. Bu oran kullanılarak analit derişimi belirlenir. Yatay eksen olan X ekseni, analitin bilinen derişimini yani standart çözeltideki analitin konsantrasyonunu, y ekseni ise A/İS oranını gösterir. Örnek olarak; kandaki sodyum ve potasyum tayinlerinde, lityum iyi bir iç standarttır. Çünkü kimyasal davranışı sodyum ve potasyuma benzemekle beraber kanda bulunmaz. Sodyumun alev emisyonla tayininde, çoğu zaman, iç standart olarak lityum katılır. Na ve 1000 ppm Li içeren çözeltiler için aşağıdaki veriler elde edilmiştir:

ppm Na I (Na) I (Li) I(Na)/I(Li) 0,1 0,11 86 0,0013 0,5 0,52 80 0,0065 Alev Spektrometri ile iç standart eklenerek yapılan Na tayini: (emisyon şiddeti) ppm Na I (Na) I (Li) I(Na)/I(Li) 0,1 0,11 86 0,0013 0,5 0,52 80 0,0065 1 1,8 128 0,0141 5 5,9 91 0,0648 10 9,5 73 0,1301 Standartlara ve bilinmeyene 1000 ppm Li eklenmiştir. Bilinmeyen 4,4 95 0,0463 r2= 0,9999 r2 = 0,9907 4,4 4,4/95=0,0463 4,63 3,57

Normal kalibrasyon grafiği Sodyumun alev emisyon tayini için iç standart yöntemini gösteren hesap çizelgesi. İç standart kullanılınca

Dış Standart ile Kalibrasyon: Dış standart numuneden ayrı olarak hazırlanan standarttır. Tersine, iç standart ise numunenin kendisine eklenir. Analit çözeltisinde matriks bileşenlerinden gelen bir bozucu etki yoksa, cihazı ve işlemleri kalibre etmek için dış standartlar kullanılır. Dış standartlar, bilinen derişimde analit içeren bir seri çözeltidir. Dış standartlar kullanılırken analitin, numune çözeltisi ve standart çözeltilerdeki eşit derişimlerinin aynı sinyali vereceği varsayılır. Yani, derişim ile sinyal arasında standartlarda geçerli olan ilişkinin, numune çözeltisinde de geçerli olduğu kabul edilmektedir. Bu tayinde, tanıklarla düzeltme yapılmış olsa bile, dış standart yönteminin temel varsayımı, çeşitli nedenlerle geçersiz duruma düşebilir. Numunede var olan fakat standartlarda ve tanıkta bulunmayan yabancı türler, numunede ve standartlarda aynı analit derişiminin, farklı şiddette sinyaller vermesine de sebep olabilir.

Temel varsayım geçerli kalsa bile, numune alma ve hazırlama aşamalarındaki kirlenmelerden dolayı hatalar da olabilir. Kalibrasyon işlemlerinden de sistematik hatalar gelebilir. Örneğin, standart yanlış hazırlanmışsa, buradan bir hata gelecektir. Analitin standartlardaki formu, numunedeki ile aynı olmalıdır. Tek yönlü bir kayma eğilimi varsa, buradan sistematik bir hata gelebilir. Rastgele hatalar da kalibrasyon grafiklerinden elde edilen sonuçların doğruluğunu etkileyebilir.

Çok Değişkenli Kalibrasyon: En küçük kareler işlemi, tek değişkenli bir kalibrasyondur. Çünkü, her numune için bir sinyal değeri kullanılmaktadır. Bir analit veya analitler karışımı için elde edilmiş çok sayıda cihaz sinyalini, derişimlerle ilişkilendirme işlemine ise çok değişkenli kalibrasyon denir. Son yıllarda aynı anda birçok sinyal üreten cihazlar yaygınlaştıkça, çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri de yaygınlaşmıştır. Çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri, çok güçlüdür. Bu yöntemlerle, karışımlardaki çok sayıda bileşen yan yana ve aynı anda tayin edilebilir ve yedek sinyallerle kesinliği arttırılabilir. Bu ölçme işlemini n defa tekrarlamanın, ortalama değerin kesinliğinde √n kat iyileşme getireceği zaten biliniyor. Bu yöntemler, ayrıca, numune çözeltisinde bozucu etkiler olup olmadığını anlamada da kullanılabilir ki, tek değişkenli kalibrasyonda bu mümkün değildir.

Çok değişkenli teknikler, ters kalibrasyon yöntemleri adını da alır Çok değişkenli teknikler, ters kalibrasyon yöntemleri adını da alır. Çoğu zaman klasik en küçük kareler yöntemi denilen normal yöntemde, model kurulurken, cihaz sinyalinin şiddeti analit derişiminin fonksiyonu olarak alınır. Ters yöntemlerde ise, derişimler sinyallerin bir fonksiyonudur. Ortamda kimyasal ve fiziksel bozucu etkilerin varlığı halinde bile, derişimleri doğru olarak bulabilme imkanı verdiği için, ters yöntemler, diğerine göre üstündürler. Klasik yöntemlerde, elde edilen matematik modelde (regresyon denkleminde), sistemdeki bütün bileşenlerin hesaba katılması gerekir. Çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri arasında, çoklu doğrusal regresyon, kısmi en küçük kareler regresyonu ve ana bileşen regresyonu en yaygın olanlarıdır. Bu yöntemler arasındaki fark, verilerdeki (sinyallerdeki) değişimlerin, derişimi bulmada kullanılışı sırasında izlenen yoldur. Çok değişkenli kalibrasyonlar için farklı kurumlarca üretilmiş yazılımlar mevcuttur. Çok değişkenli istatistik yöntemlerin nicel analizlerde kullanımı, kemometri adı verilen kimya dalını da ortaya çıkarmıştır.

Örneğin; Ni(II) ve Ga(III) karışımında, bu iyonların yan yana tayini, çok değişkenli kalibrasyona bir örnektir. Her iki katyonda 4-(2-piridilazo)-rezorsin (PAR) ile etkileşerek renkli ürünler oluştururlar. Bu ürünlerin absorpsiyon spektrumları az da olsa farklıdır ve iki ürünün oluşum hızları da tam eşit değildir. Bu küçük farlılıklardan yararlanarak, karışımdaki 2 katyon tayin edilebilir. Bu analizde, kalibrasyon modelini elde etmek için her iki katyonu da içeren 16 standart karışım kullanılmıştır. Çok dalga boylu diyot serili (DAD) spektrometre ile, 26 farklı dalga boyunda ve 26 ayrı veri aynı anda kaydedilmiştir. Bu katyonların µM mertebesindeki derişimleri, pH 8.5’a ayarlanmış bilinmeyen karışımlarda tayin edilmiş; en küçük kareler regresyonu ve ana bileşen regresyonu yöntemleri ile hesaplanan derişimlerin bağıl hatasının %10’dan daha küçük olduğu bulunmuştur.