1. Raman Spektroskopisi Raman spektroskopisinin temellerini 1928 yılında Hintli bilim adamı C.V. Raman atmış ve bu buluşundan dolayı 1931 Nobel Fizik Ödülü’nü almıştır. Şiddetli monokromatik ışın ile etkileşen moleküller, ışığı absorplamıyorlarsa ışık saçılmasına (yön değiştirme) neden olurlar. Raman spektroskopisinin temeli, numunenin GB veya NIR monokromatik ışından oluşan güçlü bir lazer kaynağıyla ışınlanmasıyla saçılan ışının belirli bir açıdan (genellikle 90 derece) ölçümüne dayanır. Yapılan uyarma analitin herhangi bir absorpsiyon pikinden yeterince uzakta olan bir dalga boyunda yapılır. Raman çizgilerinin şiddetleri en fazla kaynak ışık şiddetinin %0,001’i kadar olur. Raman spektroskopisinin değerlendirmesi, infrared spektroskopisindekiyle benzerdir. Çünkü Raman ve IR spektroskopisindeki pikler titreşim enerji seviyeleri arasındaki farktan kaynaklandığı için spektrumlarda oluşan pikler aynı dalga sayısına sahip olup, yorumları aynıdır. Dedektör sistemlerinin gelişimi ile birlikte yeniden değer kazanan bir tekniktir.

Işının Saçılması Tyndall Saçılması:Tyndall saçılması ya da Tyndall etkisi bir süspansiyondaki kolloitler tarafından ışığın saçılmasıdır. Saçılan ışın ölçümleri, polimer molekülleri ve kolloit parçacıklarının büyüklüğünü ve şeklini belirlemekte kullanılır. Rayleigh Saçılması: Boyutları gelen ışığın dalga boyundan önemli ölçüde daha küçük olan molekül veya molekül yığınlarının oluşturduğu saçılmaya Rayleigh saçılması adı verilir; şiddeti ise frekansın dördüncü kuvvetine bağlıdır. Bu yüzden mavi ışık, kırmızı ışıktan çok daha fazla saçılır. Rayleigh saçılmasının her gün görülen sonuçlarından birisi, kısa dalga boylu ışınların daha çok saçılmasından oluşan mavi gök rengidir. Saçılan ışığın büyük bir kısmının enerjisi madde ile etkileşen ışığın enerjisine eşittir (elastik saçılma). Rayleigh saçılması titreşim geçişleri hakkında bilgi vermez. Raman Saçılması: Elastik saçılma olayının yanı sıra saçılan ışığın çok az bir kısmı elastik olmayan saçılma da yapar (Raman saçılması). Saçılan ışığın enerjisinde molekül ile etkileşen ışığınkine göre oluşan fazlalık veya azlık ışıkla etkileşen molekülün titreşim enerji düzeyleri arasındaki enerji farkları kadardır (Raman kaymaları). Bu nedenle Raman saçılmasının spektroskopik incelenmesi ile de moleküllerin titreşim enerji düzeyleri hakkında bilgi edinilebilir. Işının madde içerisindeki parçacıklar (atom, iyon veya moleküller) tarafından bir anlık tutulması ve sonra bırakılmasına saçılma denir. Aslında ışın demetinin sadece küçük bir oranı saçılabilir.

Rayleigh ve Raman saçılımının esası Molekül ile etkileşen ışın absorplanmıyorsa, üç farklı tipte saçılır: 1. Rayleigh saçılımı, esnek çarpışma (saçılan ışının enerjisi = gelen ışının enerjisi) 2. Stokes saçılımı, esnek olmayan çarpışma (saçılan ışının enerjisi = Rayleigh - DE) 3. Anti-stokes saçılımı, ″ ″ ″ (saçılan ışının enerjisi = Rayleigh + DE) En düşük uyarılmış elektronik hal Temel elektronik hal 1 2 3 Sanal haller Uyarma Rayleigh saçılması Raman Saçılması Anti-Stokes Stokes DE DE

Raman spektrumu şunları içerir; • Rayleigh saçılmasına ait pik (uyarılma ile aynı dalga boyunda, yüksek şiddetli) • Stokes kayması ile ilgili bir seri pik (Daha uzun dalga boyunda, düşük şiddetli) • Anti-stokes kayması ile ilgili bir seri pik (Daha kısa dalga boyunda, düşük şiddetli) 488 nm’de Ar+ lazer kullanılarak alınmış CCl4’e ait spektrum

Raman Aktif IR Aktif IR Aktif Etkileşme sonrası molekülün titreşim enerjisi artıyorsa (uyarılıyorsa) bu tür saçılan ışımalara Stokes hatları denir. Bunun tersi olan Raman kaymalarına ise, anti-Stokes hatları denir. Bir molekülün Raman saçılması yapması için etkileşme sırasında polaritesinde değişim olması gerekir. Buna göre IR inaktif olan maddeler Raman aktif olabilirler. Simetrik gerilme Raman Aktif Asimetrik gerilme IR Aktif Eğilme IR Aktif + -

Raman ve IR’de simetrik ve asimetrik gerilimlerin karşılaştırılması: Simetrik titreşim: Birim alandaki yük dağılımı değiştiği için Raman aktiftir. Asimetrik titreşim: Birim alandaki yük dağılımı değişmediği için IR aktiftir.

CO2’in IR ve Raman Spektrumu: 4000 2000 % Transmittans İnfrared spektrumu 4000 2000 Dalga sayısı (cm-1) Raman spektrumu Saçılma şiddeti

λ seçici Kaynak Numune λ seçici Numune Kaynak Cihaz: Raman spektroskopisinde kullanılan cihaz, floresans spektroskopisinde kullanılana çok benzer. IR Absorbsiyon: λ seçici Numune Kaynak 4000 2000 % Transmittans Dalga sayısı (cm-1) Raman saçılma: λ seçici Kaynak Numune 4000 2000 Dalga sayısı (cm-1) Saçılma yüzdesi

Işın kaynağı: Raman saçılmasının şiddeti az olduğu için uyarma kaynağından çıkan ışının şiddetli olmalı gerekir. Ayrıca spektrumun karışık bir hal almaması için kaynaktan çıkan ışın monokromatik olmalıdır. Bunun için şiddetli ışın yayan lambalar kullanılabilir fakat monokromatör kullanılınca şiddetleri azalır. Bu yüzden Raman spektroskopisinde en uygun ışın kaynağı oldukça dar dalga boylarında ya da tek bir dalga boyunda ışıma yapan lazerlerdir: (Lazer: Light amplification by stimulated emission of radiation) Ar+ iyonu: 488.0 - 514.5 nm Kr+ İyonu: 530.9 - 647.1 nm He-Ne: 632.8 nm Diyot lazerler: 782 - 830 nm UV bölgede çalışan, sıvı azot soğutmalı CCD dedektör Dedektör: Günümüzde dedektör olarak, soğutmalı CCD (charge coupled device-yük eşleşmiş cihaz) dedektörler kullanılmaktadır.

Analitik Uygulamalar Raman spektroskopisi yöntemi ile katı, sıvı ve gaz örnekler incelenebilir. Raman spektroskopisi ile daha çok kalitatif analiz yapılır. Kantitatif uygulama hemen hemen hiç yoktur. Raman spektroskopisinde piklerin şiddeti polarizlenme hızları ile orantılı olduğundan IR’de pik vermeyen fonksiyonel gruplar Raman’da pik verebilirler. Bir molekülün Raman ve infrared spektrumlarının birlikte değerlendirilmesi ile nitel analiz kolaylaşır. CS2, CCl4, CHCl3 gibi organik çözücüler kullanılabildiği gibi IR’de kullanılamayan su da çözücü olarak kullanılabilir. Su moleküllerinin neden olduğu Raman hatları oldukça zayıftır. Raman spektroskopisi yönteminin IR spektroskopisi yöntemine göre bir diğer avantajı ise aynı aletle hem yakın-IR hem orta-IR, hem de uzak-IR bölgelerindeki bilgilerin elde edilebilmesidir. Bilindiği gibi, IR spektroskopisinde bu üç bölge için birden çok spektrometrelerin kullanılması gerekir. Rezonans Raman Spektroskopi: Herhangi bir analitin elektronik absorpsiyon pikine oldukça yaklaşan dalga boylarıyla uyarılması sonucu Raman piklerinin şiddetleri 102 ile 106 kat kadar kuvvetlenir. Böylece duyarlılık 10-8 M’a kadar düşebilir.

Su Raman Orta-IR Yakın-IR H2O Absorbans 0.0 0.5 1.0 2.0 Dalga sayısı (cm-1) 8000 6000 4000 3000 2000 1000 Raman Orta-IR Yakın-IR Siddet

Aseton Raman Orta-IR Yakın-IR CH3 C=O Dalga sayısı (cm-1) 3000 2000 1000 Şiddet 8000 6000 4000 Absorbans 0.0 0.5 1.0

2. Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopi Elektronların spin (kendi ekseni etrafında dönme) özelliği olduğu gibi bazı çekirdeklerin de spin özellikleri vardır. NMR spektroskopisi, şiddetli bir manyetik alan içinde çekirdeklerin 4-900 MHz (75 m - 0,33 m) aralığındaki radyo frekansı aralığındaki elektromanyetik ışınların absorpsiyonuyla dönme enerji seviyelerine uyarılmalarının ölçümüne dayanır. NMR spektroskopisinin temelleri, 1924’te Pauli tarafından atılmıştır. Pauli, bazı çekirdeklerin bir manyetik alana maruz kalınca, spin hallerinin enerjilerinin yarılacağını öne sürdü. Enerji yarılmasının bir sonucu olarak, çekirdeklerin elektromanyetik ışınları absorpladıklarını ilk gösterenler ise Bloch ve Purcell oldu. Klasik NMR spektroskopisinde fotonun frekansı sabit tutulur, manyetik alanın değeri değiştirilerek rezonans gerçekleştirilir. FT-NMR spektroskopisinde ise manyetik alan değeri sabit tutularak radyo dalgası fotonunun frekansı değiştirilir. IR spektroskopisi daha çok bir molekülde bulunan fonksiyonel grupların varlığını ortaya koyar. Kütle spektroskopisi ise, molekülün kapalı formülünü verir. Oysa bir molekül için yapı tayini, NMR spektroskopisi ile büyük ölçüde yapılabilmektedir.

Rezonans Olayı NMR spektroskopisinin temeli, çekirdeğin manyetik özelliğine dayanır. Bilindiği üzere çekirdekte proton bulunduğundan, çekirdek pozitif (+) yüklüdür. Çekirdek kendi ekseni etrafında döndüğünden, pozitif yük de bu eksen etrafında döner. → Böylece çekirdek dönerken elektrik akımı, dolayısıyla manyetik bir alan oluşur. Oluşan manyetik alanın ise belli bir manyetik momenti (m) vardır. (Momentum, bir nesnenin kütlesi ve hızının çarpımıdır: p = kütle . hız) Ayrıca kendi ekseni etrafında dönen çekirdeğin açısal momentumu da (p) vardır: m = γ . p (γ : Jiromanyetik sabiti. Her bir element için ayrı değere sahiptir.) Açısal momentum (p) kuvantlaşmıştır ve değeri h/2p’nin tam veya buçuklu katlarına eşittir. + m

Belli bir çekirdek için, spin bileşenlerinin alabileceği değer sayısı, yani p vektörünün mümkün yönelme sayısı, spin kuvantum sayısı ile (I) gösterilir. Çekirdek, yani p, manyetik kuvantum sayısı (m = 2I + 1) kadar yönlenebilir. Ancak, dıştan herhangi bir manyetik alan uygulanmazsa yönelmelerin hepsi özdeş enerjide olur. Bir elementin NMR spektroskopisinde gözlenebilmesi, spin kuvantum sayısına (I) bağlıdır. Proton ve nötron sayıları çift sayılı olan çekirdeklerin (4He, 12C, 16O gibi) net spini yoktur (I = 0). Dolayısıyla bunlar NMR’de aktif değildirler. Eğer çekirdekteki proton veya nötron sayısı tek sayılı ise, spin kuvantum sayısı (I) yarımlı değer alır. Buna örnek olarak, spini (I) 1/2 olan 1H, 13C, 19F ve 31P çekirdekleri verilebilir. 1H için manyetik kuvantum sayısı (m), m = (2I + 1) = (2.1/2 + 1) = 2 olur. Yani, bir manyetik alandaki proton, 2 farklı enerji seviyesine yarılır (yönlenir). Manyetik kuvantum sayıları, +I ve –I değerleri arasındaki bütün değerleri alacağı ve Dm = 1 kuralları gereği protonun manyetik kuvantum sayıları, m = +1/2 ve m = -1/2 olabilir.

NMR’de sinyalin şiddeti, iki enerji seviyesi arasında dağılan proton sayısının oranına bağlıdır. Boltzman eşitliğine göre bu oranı değiştirebilecek iki parametre vardır: Sıcaklık (T) ve manyetik alan şiddeti (B0). Buna göre sıcaklık düşürülürse alt seviyede bulunan proton sayısı artacaktır. Ancak numune soğutulduğunda, numune içerisinde var olan dinamik dengeler (bağ dönmesi, halka çevrilmesi gibi) statik hale geleceğinden sıcaklığın düşürülmesi uygun bir yöntem değildir. Sonuç itibariyle sinyalin şiddetini yükseltmek için manyetik alan şiddeti artırılır. Günümüzde mevcut NMR spektrometrelerin fiyatları, manyetik alan şiddetine göre değişmektedir. Örneğin, 60 MHz’lik (1.4 Tesla) bir NMR cihazı 60000 $ iken, 400 MHz’lik bir cihaz ise 350000 $ civarındadır. Durulma Olayları Çekirdek, uygun frekanslı bir ışına maruz kalırsa, düşük enerjili çekirdeklerin sayıca fazla olması sebebiyle net bir absorpsiyon (rezonans) olur. Rezonans sonucu enerji seviyelerinin populasyonu değişir. Sistemdeki dengenin tekrar sağlanabilmesi için, üst enerji seviyelerine geçmiş protonların, fazla enerjilerini vererek tekrar eski seviyelerine dönmeleri gerekir (durulma). NMR’de durulma ışımalı olmaz.

İki çeşit durulma vardır: 1. Spin-Örgü Durulması (T1) 2. Spin-Spin Durulması (T2) Çözelti içerisindeki her türlü parçacığa örgü (atom, molekül vs.) denir. Termal hareketler sonucu bu moleküller çeşitli manyetik alanlar oluştururlar. Bu alanların bazılarının frekansı, çekirdeğin kendi ekseni etrafında dönme (presesyon) frekansına uyduğunda fazla enerji örgüye verilir (spin-örgü durulması). Durulma süresi sıvılarda 10-2 ile 102 saniye kadardır. Spinler arasındaki ikinci bir etkileşim ise, spin-spin durulmasıdır. Bu safhada bilinmesi gereken tek nokta, rezonans olan bir protonun, tekrar rezonans olabilmesi için, fazla enerjisini çevreye vererek tekrar eski konumuna gelmesi şartıdır. Durulma zamanı uzun olduğu zaman, pikler keskin ve dar, durulma zamanları kısa olduğu zaman, pikler daha geniş olur. Çözücülerde olabilecek paramanyetik herhangi bir safsızlık durulma zamanlarını kısaltır.

NMR Spektroskopisinin Çalışma Prensibi NMR spektrometreleri dört ana bölümden oluşur: 1. Mıknatıs 3. Radyo frekans alıcısı (dedektör) 2. Radyo frekans (RF) vericisi 4. Kaydedici Bugün, modern cihazlarda FT-yöntemi uygulanmaktadır. Bir FT-NMR cihazında, protonların rezonansı için gerekli tüm frekanslar aynı anda numune üzerine gönderilir ve tüm protonlar aynı anda rezonansa getirilirler. NMR’de en önemli kısım mıknatıstır. Güçleri 20 Tesla’ya kadar çıkan mıknatıslar süper iletkenlerden (Nb/Ti gibi) yapıldığı için açığa çıkan ısı nedeniyle artan direnci sıfıra yaklaştırmak için sıvı helyum (4 K) ve sıvı azot ile soğutma yapılır. Tüp içerisindeki numune, manyetik alanda var olan inhomojenliğin elimine edilebilmesi için sürekli döndürülür.

Çevresel Etkiler 1. Kimyasal Kayma: Jiromanyetik sabiti, her element için ayrı bir değere sahiptir. Dolayısıyla protonlar farklı çevrelerde de olsa jiromanyetik sabiti değişmez. Buna göre bir moleküldeki bütün protonların tek bir frekansta rezonans olmaları gerekirdi. Böyle bir durumda, NMR spektroskopisi, molekülde sadece proton olup olmadığı hakkında bilgi veren bir yöntem olurdu. Farklı protonların aynı frekansta rezonans olmaması gerçeği, NMR’nin gelişmesine yardımcı olmuş en önemli faktördür. Protonlar, bağlı oldukları atomlara ve uzaydaki konumlarına göre farklı bölgelerde rezonans olurlar. Çünkü protonların etkisi altında bulundukları manyetik alan, dış manyetik alandan farklıdır. Çekirdeklerin çevresinde bulunan elektronlar, oluşturdukları sekonder manyetik alanlarla, dış manyetik alanın etkisini azaltır veya artırırlar. Elektronların oluşturduğu manyetik alanın yönü, dış manyetik alanın yönü ile zıt olduğunda, çekirdek etrafındaki dış manyetik alanın etkisi azalır (perdeleme). Bazı durumlarda ise sekonder manyetik alan ile dış manyetik alan aynı yönde olabilir (antiperdeleme).

Sonuç olarak, protonlar çevredeki elektron yoğunluğuna bağlı olarak farklı bölgelerde rezonans olurlar (kimyasal kayma). Örneğin metil asetat molekülünde iki metil grubu vardır. Bunların biri karbon atomuna, diğeri ise daha elektronegatif olan oksijen atomuna bağlı olduğu için, farklı yerlerde rezonans olurlar. Görüldüğü gibi daha az perdelenen protonların pikleri spektrumda sola doğru gidildikçe (düşük alan) oluşmuştur. NMR’de kullanılan çözücülerin ise proton (1H) içermemesi gerekir (CDCl3 gibi).

NMR’de tetrametilsilan (TMS) standart olarak kullanılır NMR’de tetrametilsilan (TMS) standart olarak kullanılır. Çünkü silisyum karbona göre daha düşük elektronegatifliğe sahip olduğundan, TMS protonları karbona göre daha çok (yüksek alanda) perdelenir. Organik moleküllerin protonları genelde daha düşük alanda (TMS sinyalinin solunda) perdelenir (pik verir). Bu yüzden TMS protonlarının sinyalleri sıfır olarak tanımlanır (standart). Herhangi bir protonun rezonans frekansının, standartın (TMS) rezonans frekansına olan uzaklığına kimyasal kayma denir. Spektrumunda kimyasal kayma (yatay eksen) milyonda kısım (ppm) olarak verilir.

Spektrumda eşdeğer protonlar eşit kimyasal kayma gösterir.

Her pikin altındaki alan proton sayısı ile doğru orantılıdır.

2. Spin-Spin Etkileşmesi: Çekirdeklerin spin enerji düzeyleri bu çekirdeklere komşu ve spini olan başka çekirdekler tarafından değişikliğe uğratılır. Spin-spin etkileşmesi sonucu belli bir çekirdeğin NMR piki, I spin değerine sahip n tane komşu (en fazla 3 bağ uzaklıktaki) çekirdek tarafından (2nI + 1) kısma yarılır ve bu pik yarılmasına spin-spin yarılması denir. Ancak, manyetik ve kimyasal çevre yönünden eşdeğer çekirdekler birbirinin NMR piklerini etkilemez.

-CH2 protonları, CH3 grubundaki protonlardan etkilenip kuvartet verir. Örnek: CH3-CH2-OH -OH bağındaki H çekirdeği hareketli olduğu için komşu çekirdeklerden etkilenmez ve singlet verir. -CH2 protonları, CH3 grubundaki protonlardan etkilenip kuvartet verir. -CH3 protonları, CH2 grubundaki protonlardan etkilenip triplet verir. OH CH3 CH2

2. Kısa Sınav 1. UV-GB spektroskopisinde en çok rastlanan elektronik geçişler, n  p * ve p  p * geçişleridir. Neden? 2. Kütle spektrumu hangi değerler değiştirilerek elde edilmektedir? 3. MALDI tekniğinde nikotinik asitin kullanılmasının amacı nedir? 4. Rayleigh saçılımı ile Raman saçılımı arasındaki fark nedir?