ANALİTİK YÖNTEM VALİDASYONU Aysel KÜÇÜK TUNCA

Validasyon Bir yöntemin validasyonu, bir veya bir seri analitin, belirli bir matriks içindeki konsantrasyonunun tayini için kullanılan belirli bir yöntemin, amaçlanan uygulama bakımından güvenirliğini göstermek için yapılması gereken bütün işlemleri kapsamaktadır. Güvenilirliği bilinmeyen bir analitik sonucun hiçbir değeri yoktur.

Konsantrasyon ölçümlerinde kullanılan bir analitik yöntemin yeterli duyarlılıkta ölçtüğünün ve uygun kesinliğe sahip olarak doğruluğunun deneysel olarak gösterilmesi gerekmektedir. Analitik yöntemlerle belirli bir matriks içindeki bir analit, yeterli duyarlılık, özgünlük, doğrusallık, geri kazanım, doğruluk ve kesinlik (gün-içi ve günler-arası) bakımlarından tam olarak valide edilmiş, uygun bir yöntem kullanılarak tayin edilmelidir. Bilindiği gibi, valide edilmiş bir yöntemin hedefi ise; bu yöntemle yapılmış sonuçlara güvenirlilik sağlamaktır.

Validasyon parametreleri nelerdir? Validasyon yaparken, analitik bir yöntemin kabul edilebilirliğini sağlayan ve validasyon parametreleri denilen aşağıdaki belirli kabul kriterlerine titizlikle uyulmalıdır: 1. Analitin belirli bir matriks içinde, saklama şartlarındaki kararlılığı (stability) 2. Doğrusallık (linearity) 3. Kesinlik (precision) 4. Doğruluk (accuracy) 5. Tekrarüretilebilirlik, Tekrarlanabilirlik (Reproducibility, repeatability) 6. Duyarlılık/hassasiyet (sensitivity) 7. Özgünlük/belirleyicilik, seçicilik (specificity, selectivity) 8. Tutarlılık, sağlamlık (ruggedness, robustness) 9. Tespit ve tayin sınırları (Limits of detection-limits of quantitation)

Stability Kararlılık: Belirli bir matriks içindeki bir analitin, amaçlanan saklama ısısında, dondurma veya çözme dönemlerinin etkisinde, oda ısısında veya diğer çevresel faktörlerin etkisindeki stabilitesidir. Stok solüsyonların ve numunenin kararlılığının da belirlenmesi gerekir. Bir çözücü içindeki analitin kararlılığı, saklama koşulları, maddenin kimyasal özellikleri, matriks ve kap sistemine bağlıdır. Kararlılık deneylerindeki koşullar, gerçek numune hazırlama ve analizi sırasında karşılaşılması muhtemel durumları yansıtmalıdır. İstenilen saklama süresinin tamamlanmasından sonra, kararlılık, cihaz tepkisinin taze hazırlanmış solüsyonların tepkisi ile karşılaştırılarak test edilmelidir.

Stabilite nasıl belirlenir? 1. Donma ve Erime Stabilitesi: Analit stabilitesi üç donma ve erime turlarından sonra belirlenmelidir. Analit ayarlanmış depolama sıcaklığında stabil değilse, stabilite örneği üç donma ve erime turu boyunca -70 derecede dondurulmalıdır. 2. Kısa Dönem Stabilitesi: 2 ile 24 saat arasında oda sıcaklığındaki analitin stabilitesidir. 3. Uzun Dönem Stabilitesi: Uzun donem bir stabilite değerlendirmesinde depolama zamanı, son örneğin analiz tarihi ile ilk örneğin toplanma tarihi arasındaki zamanı aşmalıdır. 4. Stok Çözeltinin Stabilitesi: Stok çözelti ve internal standardın stabilitesi en az 6 saatlik oda sıcaklığında değerlendirilmelidir. Stok çözeltiler, uygun periyotlarda dondurulur ya da buzdolabında tutulursa, stabilite belgelenmelidir. 5. Hazırlama Sonrası Stabilite: Otosampler içindeki bekleme zamanını içeren işlenmiş örneklerin stabilitesi belirlenmelidir.

Linearity Doğrusallık: Deneyimizde, aradığımız madde örnek içindeki miktarıyla doğru orantılı sonuçlar vermelidir. Buna doğrusallık denir. Her deney belli bir ölçüm aralığında doğrusaldır ve bu nedenle doğrusallığın bilinmesi, ölçüm aralığı konusunda bizi uyaracağından son derece önemlidir. Ölçüm aralığı ise belirlenen deney hataları içinde kalan ve tam olarak doğru sonuçları aldığımız aralıktır.

Başka bir değişle; analitik bir işlemin doğrusallığı, belirli sınırlar içinde, numunedeki analit miktarı (konsantrasyon) ile deneysel cevap arasında doğrusal sonuçların alınma özelliğidir. Uygun konsantrasyon aralığı seçilerek, cihaz cevabının (y), analitin konsantrasyonuna karşı (x) grafiğe geçirilmesiyle doğrusal bir ilişki elde edilir. Böylece hazırlanan standart kalibrasyon eğrisi üzerinde, gösterilen doğrusal ilişkiyi bulmanın en yaygın yolu olan en küçük kareler yöntemi kullanılır. y=mx+b (regresyon denklemi) ile verilen bir doğru denkleminden m ile doğrunun eğimi, b ile de kesim noktası bulunabilir. En küçük kareler yöntemiyle elde edilen regresyon katsayısı, r2  0,95 olmalıdır. Standart eğri ise, 5-8 standart nokta içermeli ve tekrarlanabilir olmalıdır.

Standart eğriden sapmalar olabilir, sapmaların bazıları pozitif bazıları ise negatiftir. İşaretine bakılmaksızın sapmaların büyüklüğünü en aza indirgemek için bütün sapmaların karesini alırız ki böylelikle sadece + sayılarla ilgileniriz. Sapmaların karelerini en aza indirgemeyi araştırdığımız bu metot, en küçük kareler metodudur (regresyon metodu) ve iki değişken arasındaki ilişkinin derecesini ortaya koyan yöntemlerin bir grubudur. En iyi doğruyu bulmak için (veriler boyunca), kalıntıların karelerinin toplamını minimize eder. Tek değişkenli kalibrasyonlar x-y arasındaki ilişkiye dayanır. İşte bu şekilde x-y arasındaki bu matematiksel ilişki, aynı zamanda lineer regresyon analizi olarak da adlandırılır. Çok değişkenli kalibrasyonlarda ise karışımların analizi kullanılır.

Doğrusallık nasıl belirlenir? Derişime karşı cihaz cevabı grafiğinin çizilmesi (en az 5 derişim seviyesine ihtiyaç vardır), Uygun istatistiksel yöntemler (en küçük kareler) ile doğru denkleminin (y = mx + b) çıkarılması, Denklemin regresyon katsayısı (r), kayması (b) ve eğiminin (m) hesaplanması.

Accuracy Doğruluk: Ölçmede hatalar ve belirsizlikler kaçınılmazdır. Bu hataları en aza indirmek ve onların büyüklüklerini kabul edilebilir doğrulukla hesaplamak gerekir. Sonuçların gerçek değere veya kabul edilen değere yakınlığını gösteren analitiksel bir işlemdir. Yani, gerçek değerden sapma, doğruluğun ölçümü olarak verilir. Doğruluk, yöntemde elde edilmiş olan ortalama test sonuçlarının gerçek analit değerine yakınlığı olarak da tarif edilebilir. Doğruluk çalışması geri kazanım yapılarak veya sertifikalı referans madde kullanılarak yapılabilir. Doğruluk, gerçek değerle ölçülen değer arasındaki yakınlığı ifade ederken, gerçek değerle ölçülen değer arasındaki fark ise hatadır (bias/inaccuracy).

Doğruluk; Mutlak hata veya bağıl hata terimleriyle açıklanır yani doğruluğun ölçüsü, hatanın büyüklüğü ile verilir. Ortalamanın gerçek (ya da doğru kabul edilen) değerden farkı yada ölçülen değer ile gerçek değer arasındaki fark, mutlak hatadır. (Xi ölçülen değer, Xt kabul edilebilir gerçek değer) Az sayıda tekrar analiziyle elde edilen bir veri takımının ortalamasının mutlak hatası aşağıdaki denklemle verilir:

Numune ortalaması olan , sınırlı bir veri takımının aritmetik ortalamasıdır (Xort). Ortalama değerin üstün olan yanı ise, analizde bulunan bütün değerleri temsil etmesidir. Tekrarlanan ölçümlerin toplamının gruptaki ölçüm sayısına bölünmesiyle elde edilen büyüklüktür: Ortanca ise büyüklük sırasına konmuş bir veri takımındaki ortaya düşen değerdir. Sonuçların sayısı çift ise, ortadaki iki değerin ortalaması ortalama olarak alınır. İdeal durumlarda ortalama ve ortancanın değerleri aynı olur.

Bağıl hata, ölçülen büyüklüğün gerçek değerden farkının gerçek değere oranıdır. Mutlak veya bağıl hataların önüne yazılan işaret eğer pozitifse, onun gerçek değerinden büyük olduğunu, işaret negatifse de bunun tersi olduğunu gösterir. Genellikle doğruluk, aşağıdaki denklemde olduğu gibi, bağıl hata ile gösterilir: Başka bir değişle; bağıl hata, mutlak hatanın büyüklüğünün ilgili ölçümün büyüklüğü ile karşılaştırılmasıdır. Buradaki Xi, ölçüm sonucu elde edilen büyüklük ve Xt kabul edilebilen doğru (gerçek) değerdir. Verilerin ortalaması için ise bağıl hata şöyle verilir:

Örnek: 12,35 ml’lik (belirsizlik 0,02 ml) bir büret okumasının bağıl hatası: Bağıl hata = (Olması gereken miktar-Bulunan miktar)/Olması gereken miktar Bağıl hata = Xi – Xt/ Xt ya da, Bağıl hata = Mutlak hata / Ölçümün büyüklüğü = 0,02 ml / 12,35 ml = 0,002 olur. Yüzde bağıl hata ise: % Bağıl Hata (Bias) = 100 x Bağıl hata olarak verilir. Yukarıdaki örnekte % bağıl hata, % 0,2’dir. Sabit bir mutlak hata, ölçüm büyüklüğü arttıkça, daha küçük bağıl hata sonucunu doğurur. Bir büret okumasındaki belirsizlik 0,02 ml olarak sabitse, bağıl hata 10 ml’lik hacim okuması için % 0,2 ve 20 ml’lik hacim için % 0,1’dir.

Örnek 500 mg’lık çökeltinin 200 ml yıkama sıvısı ile yıkanması sonucu, 0,50 mg çökeltinin kaybolduğunu varsayalım. Çözünürlük kaybından ileri gelen bağıl hata; -(0,50/500)x%100= -% 0,1’dir. 50 mg’lık çökelti için aynı miktardaki kayıp ise; %1,0’lık bir bağıl hataya sebep olur. -(0,50/50)x%100= -% 1,0’dir. Not: Önüne yazılan işaret eğer pozitifse, onun gerçek değerinden büyük olduğunu, işaret negatifse de bunun tersi olduğunu gösterir. 17

Doğruluk nasıl belirlenir? Analitik yöntem, belirlenmiş çalışma aralığında kurulmadır. En az 3 derişim seviyesinde ve en az üçer kez analizi yapılarak deneyler gerçekleştirilmelidir. Sonuç raporları: % Geri Kazanım= (ölçülen değer/ kabul edilen (bilinen) değer)x100 veya % Bağıl Hata= (ölçülen değer-kabul edilen (bilinen) değer)/ (kabul edilen (bilinen) değer)x100 içermelidir. Doğruluk belirlemede farklı yaklaşımlar vardır. Bunlar: Bilinen derişimlere sahip bir seri örneğin analizi ve sonucun gerçek değerle karşılaştırılması ile ya da sonuçların daha önce bilinen doğru bir yöntemle alınmış sonuçlarla karşılaştırılması ile, Hedef derişim üzerinde 3 düzeyde 3 deney yapılarak ekleme yapılmış numune üzerinde çalışılarak, Ekleme yapılmış numune hazırlanamıyorsa, standart ekleme teknikleri kullanarak gösterilebilir.

Precision Kesinlik: Aynı şartlarda ve aynı yöntemle elde edilen sonuçların, birbirini takip eden ölçümleri arasındaki yakınlığın derecesini, diğer bir değişle; ölçümlerin tekrarlanabilirliğini göstermek için kullanılır. Bir analitik yöntemin kesinliği, homojen ve orijinal bir numune kullanılarak, ölçümlerin tekrarlanması suretiyle kolaylıkla bulunabilir. Tekrarlanabilirlik analizleri ise, aynı yöntem, aynı analizci, aynı alet ve aynı laboratuar ile kısa sürede sağlanabilir. Bir analitik yöntemin kesinliği, prosedür homojen numuneye tekrar tekrar uygulandığında, ölçümlerin birbirine yakınlığı ile de tanımlanabilir. Kesinlik; tekrarlanabilirlik (repeatability), ara kesinlik (intermediate precision) ve kopyalanabilirlik yada yeniden üretilebilirlik (reproducibility) olarak incelenmektedir.

Repeatability Tekraredilebilirlik: Yöntem geçerliliği denetiminin en önemli ayaklarından bir tanesi de hiç şüphesiz tekraredilebilirlik çalışmasıdır. Burada aynı laboratuarda, aynı kişi, aynı örneği kullanarak istatistiksel sonuç yaratacak kadar, yani 10-15 kez deneyi tekrarlamalıdır. Elde edilen sonuçlar belli bir matematiksel anlam içermeli, sonuçlar mantık yoluyla değil, doğrudan matematik kurallar açısından değerlendirilmelidir. Tekraredilebilirlik (ya da tekrarlanabilirlik, r), aynı laboratuarda, aynı metotla, aynı cihazla, aynı numune üzerinde, aynı analizci tarafından alınan deney sonuçlarından (olabildiğince homojen şartlarda yapılan analizler için) herhangi ikisi arasındaki farkın %95 ihtimalle en fazla r kadar olacağını ifade eder. Yani aynı metotla aynı maddeden alınan analiz sonuçlarından herhangi ikisi arasında, %95 ihtimalle en az veya en çok ne kadar fark olacağını gösterir.

Analiz sonuçlarının birbirine çok yakın olması, doğru sonuçlar elde edildiği anlamına gelmez. Sonuçlar birbirine çok yakın olmalarına rağmen, doğru (gerçek) değerden uzak da olabilirler. Tekrarlama, sonuçların kalitesini arttırır ve onların güvenirliğinin bir ölçüsünü verir. Tekrar numuneleri, aynı zamanda ve aynı yolla analitik işlemin uygulandığı yaklaşık olarak aynı büyüklükteki madde kısımları olmalıdır.

Reproducibility Tekrarüretilebilirlik: Tekraredilebilirlik çalışmasını izleyen diğer çalışma da, tekrarüretilebilirliktir. Burada ise aynı çalışma değişik koşullarda tekrarlanır. Elbette işin içine değişik koşullar girince, çalışmanın yapılabildiği alan önemli ölçüde genişler. Genel bir uygulama olarak, aynı laboratuarda farklı kişiler tarafından deney tekrarlanabilir. Hatta varsa, değişik aygıtlar da işin içine sokulabilir. Daha sonra bir başka laboratuarda (yani dışarıda) tüm çalışma baştan sona yapılabilir. Dışarıda yapılan deneyler, istatistik sonuç yaratacak düzeyde (10’dan fazla olabilir) tekrarlanır. Tüm sonuçlar toplanır ve istatistiksel olarak değerlendirilir. Bu uygulama, farklı laboratuarlarda, farklı cihazlarla, farklı analistler tarafından uzun bir zaman periyodunda yapılır.

Analitik bir işlemin veya ölçümün kesinliği, yaygın olarak üç farklı terimle ifade edilmektedir; Mutlak Standart Sapma (SD): ortalamadan sapmanın ölçüsüdür. Bağıl Standart Sapma (RSD): standart sapmayı veri takımının ortalamasına bölerek hesaplarız. Verilerin kalitesinin değerlendirilmesi için mutlak standart sapmadan daha açık bilgi verir. Varyans /Varyasyon Katsayısı (CV): standart sapmanın karesi veya yüzde bağıl standart sapma (%RSD) olarak ifade edilir. Bazen bir veri takımının tekrar sonuçlarının kesinliğini ifade etmede başka bir terim daha kullanılır. Bu da yayılım veya aralık’tır. Yayılım (w), bir takımdaki en büyük ve en küçük değer arasındaki farktır.

Bu terimlerin hepsi, ortalamadan sapmanın bir fonksiyonudur ve: Kısa bir zaman aralığında ve aynı şartlarda yapılan işlemlerin doğruluğunu, Değişik gün, operatör ve cihazda yapılan deneyin sonuçlarının kesinliğini, Laboratuarlar arası yapılan deneylerin kesinliğini göstermektedir.

Kesinlik tayinlerinde, bir matriks içinde, uygun bir konsantrasyon aralığında hazırlanan standartlar, bir gün içinde veya farklı günlerde birkaç deney yapılarak analiz edilir ve her gün için ayrı bir regresyon denklemi çıkartılır. Kesinlik, her bir konsantrasyon (üç konsantrasyon önerilir) için en az altı kez tekrarlanmalıdır. Gün-içi kesinlik (intra-day) için; uygun konsantrasyon aralığında hazırlanan standartlar, bir gün içinde belli aralıklarla tekrarlanarak tayin edilir. Günler-arası kesinlik (inter-day) için de; uygun konsantrasyon aralığında hazırlanan standartlar, farklı günlerde tek bir defa analizi ile tekrarlanarak tayin edilir. Gün-içi ve günler-arası kesinlik tayininde; tüm deneydeki her bir konsantrasyon için, SD ve RSD (CV)  %15 olmalıdır.

Sistemin kesinliği ise, aynı standart çözeltiden aynı konsantrasyonda alınan örnekler ile arka arkaya ölçüm yapılarak bulunur. Okunan cevaplar için X, SD ve RSD (CV) değerleri hesaplanır. Numune Standart Sapması olan SD, verilerin ortalama değer etrafında hangi yakınlıkta kümelendiğini göstermektedir: Bağıl Standart Sapma olan RSD ise: z=2 olduğunda, RSD % olarak verilir ve bu da Varyasyon Katsayısı, CV olarak adlandırılır: Varyans ise standart sapmanın karesidir. CV = % RSD Yayılım Varyans

İstatistiksel hesaplamalarda devamlı karıştırılabilen iki kavram vardır. Bu iki kavram arasındaki en önemli fark; doğruluğun referans noktasının teorik değer, kesinliğin referans noktasının ise ortalama değer olmasıdır. Kısacası; doğruluğun derecesi, bir ölçümün ne kadar doğru ve güvenilir olduğunu, kesinlik derecesi ise onun ne ölçüde tekrarlanabilir olduğunu gösterir.

Kesinlik & Doğruluk Kesinlik; Ölçüm sonuçlarının birbirlerine yakınlığını (yani tekrarlanabilirliği) gösterir. Standart sapma, varyans veya varyasyon katsayısı ile ifade edilir. Doğruluk; Ölçülen değerin doğru ya da doğru kabul edilen değere yakınlığını gösterir. Mutlak hata ya da bağıl hata ile ifade edilir. Kesinlik Kötü Doğruluk iyi Kesinlik iyi Kesinlik iyi Doğruluk kötü

DOĞRULUK VE TEKRARLANABİLİRLİK Doğruluk kötü, Tekrarlanabilirlik kötü Doğruluk iyi, Tekrarlanabilirlik kötü Doğruluk kötü, Tekrarlanabilirlik iyi Doğruluk iyi, Tekrarlanabilirlik iyi

Hassasiyet = ölçüm sinyali/konsantrasyon Sensitivity Duyarlılık: Bir cihazın veya bir yöntemin duyarlılığı (analitik hassasiyeti), bir analit konsantrasyonundaki küçük farkları ayırt edebilme kabiliyetinin bir ölçüsü yada analitik bir yöntemin düşük konsantrasyonları saptayabilme yeteneği de denilen standart kalibrasyon eğrisinin eğimidir. Hassasiyet, analitin bir birim artışının, sinyal büyüklüğüne etkisini gösteren bir kriterdir ya da analit derişimindeki birim değişime karşı gelen sinyal şiddeti değişimidir. Hassasiyet = ölçüm sinyali/konsantrasyon

TAYİN LİMİTİ (Limit of quantification-LOQ) Miktar tayin limiti (Limit of Quantitation, LOQ) Teşhis limiti (Limit of Detection, LOD) TAYİN LİMİTİ (Limit of quantification-LOQ) Belirleme düzeyi de denilen LOQ değeri, bir deneyde bulunabilecek en düşük miktarı anlatır. Bunun için deney belli sayıda tekrarlanır. Belirleme düzeyi, ortalama değere standart sapma değeri eklenerek de bulunur. Bu konuda değişik uygulamalar vardır: Örneğin; deneyi şahit (kör) örnek üzerinden tekrarlayarak, ortalama değer üzerine, şahit deney standart sapmasının üç katı eklenebilir.

Tayin limiti (sınırı), kabul edilebilir kesinlik ve doğruluk seviyesinde belirlenebilen en düşük analit konsantrasyonudur. LOQ = ortalama + 10s LOQ = 10.SD/m formülü ile de hesaplanabilir. Bazı kaynaklarda 10 katı yerine 5 veya 6 katı olarak da geçmektedir.

Bir analitik yöntemde, miktar tayin limiti LOQ, numune içindeki analitin uygun kesinlik ve doğruluk ile miktar tayini yapılabilecek en düşük miktarı olduğundan; kalibrasyon eğrisi üzerinde, kabul edilebilir doğruluk (% 20), kesinlik (RSD% 20) ve değişkenlik ile ölçülebilen en küçük konsantrasyon yani ölçüm aralığının alt sınırı, tayin limiti olarak tespit edilmektedir. Bunun için standartlardan en az 5 örnek kullanılarak tayin yapılmaktadır. Kabul edilebilir kesinlik ve gerçeklikle ölçülen en düşük analit konsantrasyonu olan LOQ, çoğunlukla LOD’nin 2,5-3 katı olarak da hesaplanır.

TESPİT LİMİTİ (Limit of detection-LOD) Kullanılan metodun laboratuar koşullarında tespit edebildiği minimum konsantrasyondur. Ya da minimum tespit limitine (sınırına), aranan maddenin tespit edilebildiği ancak hesaplamanın yapılamadığı miktarıdır da denilebilir. Belirleme düzeyinin yani LOQ’in hesaplanabilecek en küçük miktarı da tespit limitini (LOD) verecektir. Tespitin zorlaştığı sınır belirlenir. Bu noktada 10 bağımsız analiz yapılır. Ölçümlerin ortalaması alınır. Ölçümlerin standart sapması hesaplanır (s). LOD = ortalama + 3s LOD = 3.SD/m

Tespit (teşhis) limiti (Limit of Detection, LOD) aynı zamanda, kör (blank) numuneden %95 olasılıkla ayırt edilebilecek en küçük konsantrasyondur. Yada belirli bir analitik işlemin tespit limitine yani LOD’sine, numune içindeki analitin teşhis edilebildiği miktarıdır da denilebilir. Burada bileşiğin teşhisi yapılabilir, ancak bu miktar kantitatif analiz için yeterli değildir. LOD için tipik olarak kabul edilebilen değer; gürültü seviyesinin 3 katıdır. S/G oranı, analit ile ilgili bilgiyi taşıyan sinyal S ve cihazdan gelen elektronik gürültü G’yi mukayese eder. LOD, S/G oranı, 3’e yaklaşana kadar seri olarak seyreltilmiş numuneler test edilerek de belirlenebilir.

Gürültü= max.pik – min.pik LOQ = S/G x10 LOD = S/G x3 Gürültü= max.pik – min.pik

Working Range/Linearity Çalışma aralığı ve linearite: Kantitatif metotlarda çalışma aralığının belirlenmesi gerekmektedir. Analiz sonucunda elde edilen değerler bu aralıkta yer almalıdır. Bu aralık, değerlerin doğru, kesin ve doğrusal olduğu derişim seviyelerinde, örnek içerisinde analit derişiminin daha üstü ve daha altı arasındaki aralıktır. Bu aralığın en düşük noktası LOD ve/veya LOQ değeridir. Her bir konsantrasyon düzeyine karşılık gelen cihaz yanıtı grafiğe geçirilir. Lineer regresyon analizi yapılır. Regresyon katsayısı hesaplanır. Artıklar (her bir x değeri için, gerçek y değeri ile tahmin edilen y değeri arasındaki fark) hesaplanır ve grafiğe geçirilir.

Grafik eğrisi etrafındaki rastgele dağılım lineariteye işaret eder Grafik eğrisi etrafındaki rastgele dağılım lineariteye işaret eder. Eğrinin bir tarafına olan sistematik eğilim ise lineerliğin sağlanamadığını gösterir. Regresyon katsayısı 1’e yakın olmalıdır (en azından 0,990). Regresyonda yansıtılmayan, dışlanan değerleri atmadan önce, o değere yakın konsantrasyonlarda daha ileri incelemeler veya testler yapılmalıdır.

Specificity / selectivity Özgünlük/Belirleyicilik: Analitik bir yöntemin sadece amaçlanan bileşen veya bileşenleri tayin edebilme yeteneğidir. Sadece tek bir analite cevap verecek bir yöntem için belirleyicilik (specificity), Birden fazla analite cevap verecek bir yöntem için ise seçicilik (selectivity) olarak tanımlanır. Yani seçicilik, yöntemin aranan bir analiti, örnek matriksindeki diğer maddelerden ayırabilme özelliğidir.

Selectivity Seçicilik: Bir analitik yöntemin, numunede başka bileşenlerin olması halinde, analiti kalitatif ve kantitatif olarak tayin edebilme yeteneğidir. Numuneye çeşitli başka bileşikler katılarak ve zenginleştirme yapılarak yanıta bakılabilir. İnterferansların (girişim yapanların) etkisi incelenir. Yöntemin birden fazla analit için planlanması halinde, işlem her bir analit için tekrar yapılmalıdır.

Belirleyicilik nasıl belirlenir? Örneğin Kromatogafik Yöntemler için; Rezolüsyonu (ayrılma) gösterme, Safsızlıklar ve bozulma ürünleri mevcut ise, safsızlıkları ve bozulma ürünlerini ekleme, Rezolüsyonu gösterme ve interferansları (girişim yapanları) çıkarma, Safsızlıklar ve bozulma ürünleri yoksa, belirlenmiş örnekler ile, analiz için belirlenmiş ve belirlenmemiş örnekleri karşılaştırma ve safsızlık testi için safsızlık profillerini karşılaştırma.

Ruggedness / robustness Tutarlılık: Yöntemin farklı deney şartlarında (farklı alet, farklı analizci ve farklı laboratuar gibi) tekrarlanması ile kabul edilebilir sonuç elde edilebilmesidir. Sağlamlık: Yöntemin deney koşullarındaki küçük sapmalara karşı hassasiyet derecesini gösterir. Metot oluşturulurken yapılan ve metodun performansını belirlemek için yapılan çalışmalardır. Metot performansına etki edecek parametreler belirlenir. Bu parametrelerdeki değişikliklilerin doğruluk ve kesinliği nasıl etkilediğine bakılır. Sağlamlık testlerinden elde edilen bilgi, yöntemin uygulanabilir olduğu koşulların tanımlanmasını sağlar.

Recovery Geri kazanım: Yöntem geçerliliğinde son adım, geri kazanımdır. Laboratuarda hazırlanan, içerdiği maddeler nedeniyle analizi etkilemeyecek bir örneğe katılan analizi yapılacak maddenin analiz sonunda tam olarak elde edilebilmesidir. Burada da yine 10-15 tekrar yapılır. Bir analitiksel yöntemin ekstraksiyon verimiyle yakından ilgilidir. Bir analitik yöntemde, geri kazanım ve ekstraksiyon verimliliği, numune işlemlerindeki kayıpları vermektedir. Bir matriks içindeki bir analitin geri kazanımı, saf standardın gerçek konstrasyonu ile matrikse eklenmiş ve ekstrakte edilmiş olan analit miktarının ölçüm sonucunun karşılaştırılmasıdır. Kısacası, geri kazanım ekstraksiyon verimliliğidir.

Geri kazanım çalışması iki şekilde yapılabilmektedir: 1- Aranan maddenin numuneye bilinen miktarda eklenmesi ile (zenginleştirme), 2- Sertifikalı referans madde kullanılarak. Geri kazanım (%) = (C1-C2)/C3X100 C1= Zenginleştirilmiş örneğin sonucu C2= Örnek C3= Zenginleştirme miktarı

Kullandığımız Gaz kromatografisi (GC) veya yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) gibi yöntemler ise, analitin her bir standart konsantrasyonunda, ekstrakte edilmemiş numunelerle ekstrakte edilen numunelerin pik yükseklikleri veya alanları mukayese edilerek, mutlak iyileşme (recovery) bulunur. Bu iyileşmenin tercihen %75 civarında olması kabul edilebilir, fakat %60 veya daha düşükse, ekstraksiyon işlemi tekrarlanmalıdır. Doğal olarak geri kazanımın yüzde yüz olması gerekmektedir. Ama böylesi bir çalışmayı yaptığınızda şaşırtıcı sonuçlarla karşılaşabilirsiniz. Kim yerde yüzde yüz on, kim yerde yüzde seksen gibi rakamlar deneyimizin güvenirliliği konusunda bize bilgi verirler.

Bir analitik yöntemde: Analitik teşhisin doğru yapıldığından, analitik yöntemin analitin taşıdığı safsızlıkları tam olarak belirlendiğinden, ortaya konulan analitik yöntemin numune içinde bulunan analitin durumunu ve miktarını belirleyici olduğundan tam olarak emin olunmalıdır.

İstatistiki Özet Aritmetik Ortalama: Standart sapma: Veri dağılımını ölçmek için kullanılır. Bağıl standart sapma: Varyans: Varyasyon katsayısı: %100 ile çarpılan RSD’ye denir. Standart hata: Gaus dağılımı normal simetrik bir dağılım göstermezse, ortalamanın standart hatası (ortalamanın standart sapması) bulunur. Yayılım (Aralık): Bir veri takımındaki en büyük ve en küçük değer arasındaki farktır.

b- RSD (bağıl standart sapma), Örnek: Bir kimyacı bir kan numunesinin alkol derişimi için alttaki verileri elde etmiştir. Etanol %’si, % 95 güvenle ne olmalıdır? X1: 0,084 X2: 0,089 X3:0,079 Örnek: Bir kağıt fabrikası yakınındaki havada SO2 derişimleri için tekrarlı veriler elde edilmiştir: 1,96 1,91 1,88 1,94 ppm (mg/lt) a- ortalama, b- RSD (bağıl standart sapma), c- (CV) varyasyon katsayısı değerlerini hesaplayınız. 49

Örnek Bir kan numunesinin kurşun içeriğini tayin etmek için yapılan tekrar analizlerinde aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir. Bu veri takımının ortalamasını, standart sapmasını, varyansını, bağıl standart sapmasını, varyasyon katsayısını ve yayılımını hesaplayınız. Numune Xi Xi2 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 0,752 0,565504 2 0,756 0,571536 3 0,752 0,565504 4 0,751 0,564001 5 0,760 0,577600 ƩXi = 3,771 ƩXi2 = 2,844145