MOLEKÜLER GENETİK VE REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ Prof.Dr.Öztürk ÖZDEMİR 2005-2006

The Tools of Molecular Biology

REKOMBİNASYON Rekombinasyon: Yenibileşim - yenidenoluşum. Bir molekülün-hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin(orijinal) yapısından farklılık göstermesi durumudur. I - In vivo rekombinasyon II- In vitro rekombinasyon

Klon (Clone);  Bir tek atasal diploid hücreden mitoz bölünme yoluyla birden fazla hücre eldesine denir.  Rekombinant DNA teknolojisi ile sentezlenen identik DNA/gen kopyalarına denir. ”Gene cloning”

Genetik Klonlamada Tarihçe Gelişme Araştırıcı Yıl  Deniz hayvanlarında döllenme O.Hertwig 1875  İlk kez anne rahmi dışında döllenme L.Schenk 1878  Tüp ortamında insan yumurta hücresi döllendi MF Menkin 1944  Dondurulmuş sperm ile inek yumurtası döllendi 1952  Deney tüpünde döllenen bir memeli yavru doğdu 1959  Dondurulmuş embriyodan yavru fareler elde edildi 1972  Louise Brown isimli bebek deney tüpünde döllendi anne rahmine yerleştirilerek sağlıklı doğum yaptırıldı 1978  Avusturalyada donmuş embriyodan sağlıklı bir kız çocuğu elde edildi 1984

Genetik Klonlamada Tarihçe Gelişme Yıl  Kiralık anne Mary Beth bebeğini vermeyi redetti. 1986  Embriyo hücrelerinin çoğaltılmasıyla çok sayıda kuzu elde edildi 1987  İnsan embriyosu klonlandı çok tepki aldı J.Hall 1993  Dolly klonlandı I.Wilmut 1997  Fransada bir dananın 63 klonu elde edildi 1999  Totipotent stem hücrelerinden deneysel organogenezis 2000  Farede gen klonlama yöntemiyle insan kulağı gelişimi sağlandı 2001  Avusturalyada bir at klonlama ile Coada eşek doğurdu 2002  Amerikada ex vivo yapay rahim geliştirildi 2002

Klonlama Tipleri  DNA /Gen düzeyinde klonlama  Hücre düzeyinde klonlama  Organizma /çekirdek düzeyinde klonlama

Başarılı Klonlama Yapabilmek İçin Gen;  Bağımsız olarak replike olabilmeli  Konak hücreye kolaylıkla transfer edilebilmeli  Seleksiyona olanak tanımalı

Memeli Hücrelerine Gen Transfer Teknikleri  Microinjection***  DAAE-Dextran Mediated  Electroporation  Lipofection  Calcium Phosphate***  Protoplast Fusion  Polyprene  Viral infection*** (Lentivirus, Retrovirus, Adenovirus) *: Yaygın kullanılan yöntemler

Genetik Klonlamada Kullanılan Vektörler  Plazmid 5-10 kb  Bakteriyofaj 20 kb  Cosmid 50 kb  YAC 100 kb  Baculovirus 150 kb  BAC 200 kb  PAC 250-300 kb  Lentivirus ** ~ 100-200 kb

The construction of Mammalian Transfection Vector For Expression of Cytosine- 5 Specific DNA Methyltransferase Gene M.Msp1 In Cultured Cells Ozturk OZDEMIR Received 01.05.1997

STOPLAZMİK KALITIM (YUMURTA HÜCRESİ) Regülatör - modülatör proteinler Yumurta polarity genler Segmentasyondan sorumlu genler (25 adet) Yumurta hücresindeAnterioposterior gradiyent farkı Remodelling faktörler ; zigotik effect integrinler transkripsiyon faktörleri pair-rule genler segment polarity genler Homeodomeik, Hox (Homeobox) fetusa ait genler

Nükleer Transplantasyon Wilmut ve arkadaşları donör hücre olarak 6 yaşında sağlıklı bir koyunun meme epitel hücresi ve resipient hücre olarak ise aynı koyunun metafaz II evresinde bekletilmiş enucleated yumurta hücresi kullandılar. Klonlama sonrası elde edilen ve annesiyle %100 aynı genotip ve fenotipte olan sağlıklı kuzuya DOLLY adını verdiler.

DOLLY Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

Nükleer Klonlamanın Önemi  Yumurta hücresinin embriyogeneziste spermden farklı artı(+) öneminin olduğu,  Ökaryotik hücrenin G0 evresinde totipotent kromatin organizasyonu kazandıği,  Metafaz II evresinde yumurta hücresinin klonlama için en uygun stage olduğu,  Memelilerde eşeysiz üremenin mümkün olduğu,  Bir gen yerine çekirdeğin tamamının transplante olabileceği gösterildi

Klonlama Sonrasında;  Unipotent hücrenin totipotent hücreye dönüştürülmesi,  Sinir hücrelerinin rejenerasyonu,  Telomerlerde ” end replicatin problem”giderilerek, yaşlanmanın geciktirilmesi,  Stem hücrelerinden spesifik doku eldesi,  Epigenetik modifikasyonu ile kanser tedavisine yeni bir yaklaşım, “Ex vivo gene replacement” ile genetik tedavi ve  İnsan genom projesi önemli bir ivme kazanmıştır.

Goals of DNA Technology Isolation of a particular gene or sequence Production of large quantities of a gene product Protein or RNA Increased production efficiency for commercially made enzymes and drugs Modification/improvement of existing organisms Correction of genetic defects