Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler XII.Ulusal Biyokimya kongresi Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen Analizi Kursu

XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sunum Planı Semen analizinde araştırma test prosedürleri Reactive oxygen species (ROS) Sperm Penetration Assay (SPA) DNA Hasarı (Comet Assay) Genetik testler Y-Kromozom Delesyonu Fluorescent In situ Hybridization (FISH)

Semende ROS Bu test semendeki reaktif oksijen radikalleri (ROS) miktarını belirlemek amacıyla yapılır superoxide anion (•O2–) hydrogen peroxide (H2O2) hydroxyl radical (•OH) hypochlorite radical (•OHCI) ROS luminometre veya spektrofometre ile değişik parametreler kullanılarak ölçülebilir.

ROS luminometre prosedürü Semen numunesi alındıktan hemen sonraki 30 dakika içinde testin yapılması gerekmektedir. ROS luminometre kullanılarak relative light units (RLU) olarak ölçülebilir. Fazlaca arttığı durumlarda ROS;sperme direkt olarak, lipid peroksidasyonu yoluyla ve DNA hasarı yaratarak zarar verir. Ancak fizyolojik koşullarda ROS sperm kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu için gereklidir.

Sperm Penetration Assay (SPA) Bu test ile spermin hamster yumurtasını penetre etme yeteneğine bakılarak, spermin insan yumurtasını dölleme potansiyeli ölçülmektedir. 1989’dan beri uygulanmaktadır. Çalışmalarda SPA test pozitifliği ile IVF başarısı arasında korelasyon gösterilmiştir. Ancak testin yanlış negatif sonuçların olması başarısını azaltmaktadır.

XII.Ulusal Biyokimya kongresi SPA Prosedürü Hasta spermi test yolk buffer (TYB) içinde 48 saat bekletilir. Dişi hamstırlarda ovulasyon indüksiyonu yapılır. Hasta spermleri yıkanır ve swim-up prosedürü uygulanır (90 dakika 37 C ‘de inkübe edilir). Toplanan hamstır yumurtaları hyalüronidaz ile işleme tabii tutularak kumulustan ayrılır. Arkasından tripsin ile işleme tabii tutularak zona uzaklaştırılır.

SPA Prosedürü Zonası uzaklaştırılan hamstır yumurtaları ve spermler beraberce 370 inkübe edilir. Yumurtalar yıkanır ve lam üzerine alınır. Her bir yumurtayı penetre eden sperm sayısı kaydedilir.Bu sayı 5’ten büyük ise test normal kabul edilir.

XII.Ulusal Biyokimya kongresi DNA Hasarı Diğer testleri normal olan pek çok sperm örneğinde DNA hasarı (fragmentasyon) olabilir. İnfertil erkeklerin spermlerinde yüksek düzeyde DNA hasarı gözlenmektedir1. Ayrıca DNA hasarı embriyo bölünmesinde bozulma2, açıklanamayan infertilite ve tekrarlayan erken düşük ile ilişkilidir. 1Irvine DS, et al, 2000; 2Morris ID, et al, 2002

TEST PRENSİP TANIMLAMA YÖNTEMİ AVANTAJ DEZAVANTAJ Sperm Chromatin Structure Assay® (SCSA) or DNA Integrity Assay Susceptibility to DNA denaturation Flow cytometry Correlation to other tests Standardized High sensitivity Clinically significant Large number of cells analyzed Special equipment Acridine Orange Test (AOT) Fluorescent microscopy Simple Inexpensive Indistinct colors Poor correlation with other test Interlaboratory variations Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Deoxyuridine Triphosphate Nick End Labeling (TUNEL) Single- and doublestrand breaks microscopy- Bright field In Situ Nick Translation (ISNT) Single-strand breaks Specific to endogenous Clinically not proven Comet assay (neutral and alkaline) Single- and double strand breaks (double-strand breaks for neutral) Single-cell gel electrophoresis High specificity Quantification of DNA damage in individual cell Time consuming Not standardized 8-Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) Assay Measurement of DNA oxidation Detecting 8-OHdG High performance Liquid chromatography Quantitative Artifactual oxidation

Comet Assay Test Prosedürü (Single-cell gel electrophoresis assay) XII.Ulusal Biyokimya kongresi Comet Assay Test Prosedürü (Single-cell gel electrophoresis assay) Sperm agaroz jel ile karıştırılır ve slayt üzerine yayılır. Sperm alkali ortamda eritilir ve denatüre edilir. Slayt elektroforeze tabii tutulur. Daha sonra etanol ile dehidrate edilir ve Syber green boyası ile boyanır. Normal :≤ % 27

Comet Assay Normal DNA Hasarı %100 L. Murthy

XII.Ulusal Biyokimya kongresi TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Genetik Testler Genetik nedenler erkek infertilitesinde %15 oranında tespit edilmektedir. Sperm konsantrasyonu <10x106 ise genetik testler önerilir.

Genetik Testler Kistik Fibroz Gen mutasyonları (KBVDY) TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Genetik Testler Kistik Fibroz Gen mutasyonları (KBVDY) Yq kromozomu mikrodelesyonları (Azospermi/ağır oligozospermi) Kromozom anormallikleri (Klinefelter sendromu)

Y-Kromozom Delesyonu Y Kromozom mikrodelesyonlarına azospermik (8-12%) ve oligospermik erkeklerde (6%), nadiren de fertil erkeklerde rastlanmaktadır. Y-Kromozom delesyonu olan ve ICSI düşünen hastaların, erkek çocukları azospermi açısından yüksek riske sahiptirler.

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Test Prosedürü Kullanıma hazır ekstraksiyon kiti(Gentra sistem) ile DNA elde edilir. PCR (multiplex rxn) yapılır. PCR ürünleri agaroz jelde yürütülür.

1 2 1 2 L.Murthy B Primer A Primer SY143 SRY SY257 SY134 SY255 SY269 TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 B Primer A Primer SY143 SRY SY257 SY134 SY255 SY269 E1FAY SMCY SY149 SY243 1 2 1 2 1-Patient with deletions 2-Normal L.Murthy

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 AZFa ve AZFb delesyonları testiküler sperm eldesi açısından negatif prognostik değer taşır. AZFc delesyonu olan hastalarda %50 oranında testiküler sperm eldesi şansı vardır

Fluorescent In situ Hybridization (FISH) Bu prosedürde, dekondanse sperm nükleuslarının yapısını indirekt olarak belirleyen DNA-spesifik işaretli prob kombinasyonları kullanılmaktadır.

Sperm kromozom anomalileri XII.Ulusal Biyokimya kongresi Sperm kromozom anomalileri Sex Chromosome disomy 21 disomy 18 disomy 13 disomy Diploid sperm

XII.Ulusal Biyokimya kongresi FISH Prosedürü Spermlar yıkanır ve slayda fikse edilir.. Sperm baş bölgesinin kompakt kromatin içeriği dekondanse edilir. Disülfit bağlarını kırmak için dithiothreithol (DTT) kullanılır. DNA prob kitleri kullanılır. CEP 18,X,Y probu x,Y ve 18. kromozomda sentromerik bölgedeki dizileri belirler. LSI 13,21 probu 13 ve 21.kromozomdaki dizileri belirler. CEP 18,X,Y probu kullanılmış

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Normal Y,18 Normal X,18

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Abnormal X,Y,18 Abnormal: XY18

Disomy 18: XY,18-18 Disomy 18 XY,18-18 TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Disomy 18: XY,18-18 Disomy 18 XY,18-18

Normal haploid: 13, 21 Normal haploid; 13,21 TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Normal haploid: 13, 21 Normal haploid; 13,21

Disomy 21: 13, 21-21 Disomy 21: 13, 21-21 TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 Disomy 21: 13, 21-21 Disomy 21: 13, 21-21

TKBD-Semen Analizi Kursu 10.04.2017 DDiploid; 13-13, 21-21

Teşekkür ederim…