ORGANİK KİMYA VE BİYOKİMYAYA GİRİŞ, LABORATUVAR ARAÇ-GEREÇLERİ IV Doç.Dr. Mustafa ALTINIŞIK ADÜTF Biyokimya AD 2006

Analiz yöntemleri 1) Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler -Kolorimetri -Fotometri -Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm -Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm 2) İyon selektif elektrotlar (ISE) yardımıyla ölçüm 3) Nefelometri ve türbidimetri 4) Florometri 5) İmmünokimyasal yöntemler 6) Elektroforez 7) Kromatografi

Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler Beyaz ışık, farklı dalga boyu ve farklı renklere sahip ışınların bir bileşimidir. Dalga boyu, uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir: 1 nm=1 m=10Ao

Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır.

Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır. Sarı-Mavi Kırmızı-Yeşil

Herhangi bir çözeltiye gönderilen ışığın çözelti tarafından tutulmasına absorpsiyon (soğurulma-emilim), ışığın çözeltiden geçişine transmisyon denir.

Çözeltiye gelen ışık şiddetiyle çözeltiden çıkan ışık şiddeti arasında matematiksel bir ilişki vardır; bu ilişki, Lambert-Beer kanunuyla ifade edilir. Lambert-Beer kanunu: Bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde katettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır.

Kolorimetri Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir. Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir.

Fotometri Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir. Aö =   cö  l Astd =   cstd  l cö = (Aö/ Astd)  cstd cö = (cstd/ Astd)  Aö cö = (Faktör)  Aö

Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm Alev üzerine çözelti çok küçük damlacıklar halinde (sis şeklinde) püskürtülür. Alevin ısı etkisiyle, çözeltideki madde atomlarının elektronları uyarılır ve bu şekilde daha üst bir enerji seviyesine çıkmış olan anstabil elektronlar daha sonra eski enerji düzeylerine dönerken aradaki enerji farkını ışık olarak dışarı salarlar. Bu ışık, çözeltideki madde konsantrasyonuyla orantılıdır ve alev fotometresinde ölçülür.

Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm Temel prensibi alev fotometresinin tersidir. Alev fotometresinde uyarılmış atomun saldığı ışın ölçüldüğü halde AAS’nde atomun tuttuğu ışın ölçülür. Bu cihazlarla biyolojik sıvılarda bulunan Fe, Cu, Zn, Co, Pb, Li gibi eser elementler ölçülür.

İyon selektif elektrotlar (ISE) yardımıyla ölçüm Özel elektrotlar yardımı ile numunelerde iyon farkının bir membranda (zarda) meydana getirdiği potansiyel farkı ölçülür. Böylece numunelerdeki madde konsantrasyonu tayin edilir. Ölçülen her bir element için ayrı bir elektrot vardır.

Nefelometri ve türbidimetri Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir. Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine göre 90o açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları ölçen farklı tip nefelometreler vardır.

Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan dolayı ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için, absorpsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık ve fotometreler veya kolorimetreler kullanılır.

türbidimetre nefelometre

Fluorometri Bazı bileşikler, ışık (enerji) absorbe ettiklerinde uyarılırlar; elektronları düşük enerji seviyesinden yüksek enerji seviyesine çıkarlar. Sonra bu elektronlar eski enerji seviyelerine veya onun biraz üstündeki bir seviyeye dönerler ve dışarıya ilk aldıkları enerjiye eşit veya biraz daha az enerjiyi ışık tarzında salarlar. Uyarılma (eksitasyon) ortadan kalkınca ışımanın 10-10-10-6 s sürmesi fluoresans, 10-6-102 s sürmesi fosforesans olarak tanımlanır. Fluorometride, fluorometre denilen cihazlarla madde konsantrasyonu, fluoresans ışımanın ölçümü ile tayin edilir.

İmmünokimyasal yöntemler Düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümünde kullanılan yöntemlerdir. Bu yöntemlerin ortak noktası, ölçülecek maddeye karşı bir antikor içermesi ve ortamda bir işaretleyici olmasıdır. Deney sonunda bu işaretleyicilerin miktarı ölçülerek madde miktarı hesaplanır. Radyoimmünoassay (RİA) yönteminde işaretleyici olarak radyoaktif madde kullanılır. Fluoresan immünoassay (FİA) yönteminde işaretleyici olarak fluoresan madde kullanılır. Luminoassay ve kemilüminoassay (LİA) yönteminde işaretleyici olarak luminesan madde kullanılır. Enzimimmünoassay (EİA) yönteminde işaretleyici olarak enzim kullanılır.

Elektroforez Elektroforez, yüklü partiküllerin bir elektrik akımının etkisiyle birbirinden ayrılması işlemidir. Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır: -iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı) -elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı -uygun pH’da bir tampon çözelti -birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre.

Elektroforez çeşitleri: -Kağıt elektroforezi -Agaroz jeli elektroforezi -Selüloz asetat elektroforezi -Poliakrilamid jel elektroforezi -Nişasta jeli elektroforezi -Kapiller elektroforez

Kromatografi Kromatografi, herhangi bir karışımdaki maddelerin biri sabit diğeri hareketli olan iki ayrı çözücüye karşı olan fizikokimyasal özelliklerinden faydalanılarak birbirlerinden ayrılmaları işlemidir. Hareketli faza göre gaz kromatografi ve sıvı (likit) kromatografi olarak sınıflandırılır. Yüksek performanslı likit kromatografi (HPLC), normal sıvı kromatogarafi cihazının gelişmişidir. Ayrıştırma işlemi için ya ince tabakalar veya kağıt ya da kolonlar kullanılır.

Ayırma mekanizmalarına göre de farklı kromatografi çeşitleri vardır: -Adsorpsiyon kromatografisi -Partitisyon kromatografisi -İyon değişimi kromatografisi -Afinite kormatogarfisi -Jel filtrasyon kromatografisi

Deney tüpleri-santrifüj tüpleri Laboratuvar uygulamalarında kullanılan cam ve diğer malzemeler Deney tüpleri-santrifüj tüpleri

Beher (beherglas)-erlen (erlen mayer)

kapsül huni ayırma hunisi baget ependorf tüpü tüp sporları

Cam balonlar-balon jojeler

Dereceli silindirler (mezürler)

Havan ve havan eli-temizleme fırçaları-damlalıklı şişeler

pH kağıtları-pipetler

Büret-bunzen beki-piset-puar

Benmari (su banyosu) pHmetre

santrifüj