GEN TEDAVİSİ Prof.Dr.Öztürk ÖZDEMİR Nisan 2006

GEN TEDAVİSİ  Kalıtsal geçişli bir hastalığın gen düzeyinde yapılan onarımlarla ortadan kaldırılmasına “gen tedavisi - gene therapy” adı verilir.  İki şekilde yapılır; a- Biyosentez b- Terapi

Gen Tedavisi Bir kişinin hastalığını tedavi etmek yada durumunu iyileştirmek amacı ile hücrelerinin genetik modifikasyona uğratılması işlemi.

Gen Tedavisi Modifikasyonun etkisine ve modifiye hücrelerin tiplerine göre; Germline gen tedavisi Somatik gen tedavisi

Germ hücreli gen Tedavisi Gamet/zigot/erken embriyo’ya yapılan genetik modifikasyonlardır.

Somatik Gen Tedavisi Hastalığa yol açan doku veya spesifik hücrelerdeki genetik sorunun düzeltilmesidir. İnsandaki tüm çalışmalar somatik hücrelerdeki genetik bozukluğun düzeltilmesine yöneliktir Somatik hücreler çeşitli yollar ile modifiye edilebilir; Gen artışı/eklenmesi Gen değiştirme Hedeflenmiş gen ekspresyonunun baskılanması Hedeflenmiş spesifik hücrelerin öldürülmesi

A- BİYOSENTEZ  Eksik yada yanlış sentezlenen bir gen ürünün (protein) in vitro ortamda sentezlenerek organizmaya verilmesi - eksikliğinin giderilmesini amaçlar. - Belli aralıklarla tekrarlanmayı gerektirir. - Konak hücre, vektör ve besi ortamı gerektirir. - Konak hücre olarak genellikle bir bakteri hücresi kullanılır - Ökaryotik bir hücreye ait genin intron alt birimi içermemesine dikkat edilir. - Sentez sonrası modifikasyonlar gereklidir: 1-Rekombine protein şeklinde sentezlenen peptidin CnBr (Siyanin Bromür) ile muamelesi ile (methionin taşıması şartıyla) öncelikle non-rekombine hale getirilmesi, 2- Proteinin saflaştırılması, 3- Konsantrasyon analizi ve uygulamaya hazır hale getirilmesi ve 4- Pazarlama

ÜRÜNLER I- Somatostatin (büyüme hormonu inhibitörü olarak) II- Büyüme hormonu (büyüme geriliklerin giderlmesi, 3 derece ağır yanıkların tedavisi) III- Sinir sistemi inhibitörleri (Ağrı - acı ve stres durumunda tedavi edici olarak kullanılır) - Endorfinler (opioid peptitler) - Enkefalinler(opioid peptitler) IV- İnsülin(rekombine yolla elde dilen insülin preparatları diğerlerine oranla daha avantajlıdır). A zinciri (21 aa) ve B zinciri (30 aa) V- İnterferonlar (F- İnt, L-İnt), Viral immünyetmezliklerin tedavisi. VI-İnterlökinler (çeşitli kanser grupları tedavisinde) VII-Hemofilik faktör VIII VIII-Ürokinaz IX- Aşılar

GEN TEDAVİ YÖNTEMLERİ Tedavi Hastalık I-Eksik proteinin verilmesi (antihemofilik protein) Hemofilia II- Eksik vitamin - koenzim verilmesi B6 Sistinirua B12 Metilmalanisidemia Biotin Propicidinemia D D-resistant riketsilar III- Diyetden substrat çekmek III-a.Amino asit; Fenilalanin Fenilketonuri Lösin, izolösin ve Valin Maple Syrup Urine Disease Methionin Homosistinuria III-b. Karbonhidrat; Galaktoz Galaktozemia

Tedavi Hastalık IV- Eksik ara ürün ilevesi III-c.Lipidler Kolesterol Kolesterolemia III-d. Total Protein Üre döngü defektleri IV- Eksik ara ürün ilevesi Kortizon Adrenogenital sendromu Cystein Homosistinuria Tiroksin Konjenital kretinizm Uridin Orotik asidinemia V- Koruyucu VI- Hasta dokunun yenilenmesi Böbrek transplantasyonu Polikistik böbrek anomalisi Korneal graft Konjenital katarakt Kemik iliği transplantasyonu İmmünyetmezlikler VII- Zararlı materyalin uzaklaştırılması (Dializ) Polikistik böbrek anomalisi VIII- Hasta dokunun uzaklaştırılması (Kolektomi) Poliposiz koli

B- GEN TERAPİSİ 4- siRNA tedavisi I- Supressör tRNA aracılı tedavi II- Demetilatörler / Hipermetilatörler aracılı tedavi III- Gene replacement A- Embriyonal hücre (Germline) tedavisi B- Somatik hücre - doku tedavisi C- Elemanları 1- Hasta-mutant genin ilgili hücre-dokudan uzaklaştırılması 2- Sağlıklı, non-mutant genin eldesi 3- Host hücre-dokuya vektör aracılı gen transferi 4- siRNA tedavisi

Gen Transferinde Kullanılan Vektörler  Plazmid 5-10 kb  Bakteriyofaj 20 kb  Cosmid 50 kb  YAC 100 kb  Baculovirus 150 kb  BAC 200 kb  PAC 250-300 kb  Lentivirus ** ~ 100-200 kb Mikroinjection değişken

LENTİVİRUSLAR  Gen tedavisinde vektör olarak kullanılmak üzere ( özellikle somatik hücre gen tedavisinde)non-patojen hale getirilmiş viruslara denir. A- Adenovirus orijinli lentiviruslar (DNA) : 30 kb DNA B- Retroviral lentiviruslar(RNA) : 8 kb DNA kabul eder C- Non-viral vekrörler (liposomlar vs)

LENTİVİRUS ARACILI GEN TRANSFERİNDE BAŞARISIZLIK NEDENLERİ 1- Lizojeni zayıf olabilir 2- Düşük ekspresyon 3- Daha büyük (uzun DNA) gen transferi zor 4- Virusa karşı olası immün yanıt gelişebilir 5- Onkogenezis

GEN TEDAVİSİ YAPILAN GENETİK HASTALIKLAR Hastalık Hedef hücre Gen SCID (ADA yetmezliği) Kemikiliği stem adenosine deaminase Hemophilia B Hepatosit, deri fibroblast Faaktör IX Familial hypercholesterolemia Hepatosit LDL reseptör Cystic fibrosis Solunumyolu epitel CFTR Malignant melanoma Melanoma tümör HLA B7 DMD Myoblastlar Dysrophin Akciğer kanseri Tümör Normal p53 Beyin tümörü Beyin herpes timidine kinase Ovum kenseri Tümör herpes timidine kinase

TEDAVİ EDİLMEK İSTENİLEN HÜCRELER  (Hedef dokular genellikle: Karaciğer, beyin, kas, kemikiliği ve eklemler olmaktadır) Bunlar; 1- Kolay edinilebilir olmalı 2- Kültüre edilebilinmeli 3- Manipülasyonlara müsait- dayanıklı olmalı 4- Vücuda dönüşümleri kolay olmalı 5- Lentivirus transfeksiyonuna uygun olmalı 6- Replase sonrası olabildiğince uzun yaşamalı. 7- Bölünebilme potansiyeli yüksek olmalı (telomerik DNA uzunlukları ideal olmalıdır).

1. Gen Artış Tedavisi Fonksiyon kaybının olduğu durumlarda X geni Hastalıklı hücreler Normal fenotip X geninin ürünü artar Fonksiyon kaybının olduğu durumlarda Örneğin, kistik fibröz BMD tedavisinde Kanser tedavisinde Tümöre karşı immün yanıtın arttırılması veya defektif tümör supressör genin değiştirilmesi

2. Hedeflenmiş Gen Mutasyonunun Düzeltilmesi X geni Hastalıklı hücreler (mutant X geni) Normal fenotip (mutasyon fonksiyonel gen ile düzeltilir) Fonksiyon kazandıran mutasyonu olan hastalıkların tedavisinde “Gene replacement” tedavisi

4. siRNA tedavisi siRNA komplementerlik tedavisi Patojenik genin ekspesyonunun engellenmesi siRNA komplementerlik tedavisi Özellikle infeksiyon hastalıklarının tedavisinde Kanserde aktive olmuş onkogenlerin baskılanmasında Otoimmün hastalıklarda Kalıtımsal hastalıklarda fonksiyonu artan mutant allelin baskılanmasında

4a. Hastalıklı Hücrelerin Direkt Öldürülmesi İlaç Toksin geni Proilaç geni Hastalıklı hücreler Eksprese olan toksin tarafından hücreler öldürülür İlaç tarafından hücreler öldürülür

Beyin tümöründe in vivo prodrug ilaç yaklaşımı Retrovirusler Herpes simplex Thymidine- kinase üretecek şekilde yapılandırılır Vector-üreten hücreler tümöre enjekte edilir, virüs sadece bölünen tm hücresini enfekte eder Prodrug Gancyclovir IV verilir HsTK + hücreler bunu toksik gcv-triphosphat a dönüştürür ve hücre ölür!

4b. İmmün Sistem Hücreleri Tarafından Hastalıklı Hücrelerin Öldürülmesi Antijen geni Sitokin geni Hastalıklı hücre hastalıklı olmayan hücre, özellikle immün sistem hücresi Artmış immün yanıttan dolayı hastalıklı hücrelerin öldürülmesi

Somatik Gen Tedavi Stratejileri Ex vivo gen tedavisi In vivo gen tedavisi Hedef hc’lere başarılı terapötik genetik materyal aktarımı (gen transferi)

ex vivo Gen Tedavisi Hastanın kendi hücreleri kullanılır (otolog) immun rxn gözlenmez pahalıdır Transfeksiyon mümkün olduğu kadar verimli olmalı Transgenin devamlı ekpresyonuna ihtiyaç vardır.

Ex Vivo Gen Tedavisi

in vivo Gen Tedavisi Hastanın vücudundaki hücrelere genetik manipulasyon yapılır. Düzeltici gen nasıl verilmeli? Retroviral vektörler İnsert’ün büyüklük limitasyonu Güvenlik faktörleri Hedef hücrelerin aktif olarak çoğalmaları gerekmekte Diğer seçenekler Çıplak DNA’nın enjeksiyonu Lipozomlar Partikül bombardımanı

İn vivo Gen Transferi Non-Viral -Plasmidler -Oligonukleotitler -Liposomlar

Viral -AV vektörler -AAV vektörler -Retro vektörler

Gen Transferinde Etkinlik Spesifiklik Uzun süreli ekspresyon İmmun yanıt Toksisite

293T Non-replikatif Lentivirus Transfer vektörü gag/pol Rev Zarf (VSV-G) 293T Non-replikatif Lentivirus