Mutasyon Analiz Teknikleri I Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri I Prof. Dr. Hilâl Özdağ

DHPLC Transgenomic/WAVE http://www.transgenomic.com/flash/DHPLCFlash2.asp

DHPLC http://insertion.stanford.edu/melt.html BRCA ex1 CAATAGGTAGCGATTCTGACCTTCGTACAGCAATTACTGTGATGCAATAA GCCGCAACTGGAAGAGTAGAGGCTAGAGGGCAGGCACTTTATGGCAAACT CAGGTAGAATTCTTCCTCTTCCGTCTCTTTCCTTTTACGTCATCCGGGGG CAGACTGGGTGGCCAATCCAGAGCCCCGAGAGACGCTTGGCTCTTTCTGT CCCTCCCATCCTCTGATTGTACCTTGATTTCGTATTCTGAGAGGCTGCTG CTTAGCGGTAGCCCCTTGGTTTCCGTGGCAACGGAAAAGCGCGGGAATTA CAGATAAATTAAAACTGCGACTGCGCGGCGTGAGCTCGCTGAGACTTCCT GGACGGGGGACAGGCTGTGGGGTTTCTCAGATAACTGGGCCCCTGCGCTC AGGAGGCCTTCACCCTCTGCTCTGGGTAAAGGTAGTAGAGTCCCGGGAAA GGGACAGGGGGCCCAAGTGATGCTCTGGGGTACTGGCGTGGGAGAGTGGA TTTCCGAAGCTGACAGATGGGTATTCTTTGACGGGGGGTAGGGGCGGAAC CTGAGAGGCGTAAGGCGTTGTGAACCCTGGGGAGGGGGGCAGTTTGTAGG TCGCGAGGGAAGCGCTGAGGATCAGGAAGGGGGCACTGAGTGTCCGTGGG GGAATCCTCGTGATAGGAACTGGAATATGCCTTGAGGGGGACACTATGTC TTTAAAAACGTCGGCTGGTCATGAGGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGAC CAACGTGGTGAAACTCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCG TGGTGCCGCTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTAGAAC C with 851 base pairs Melting temperature of entire strand: 61.25° Temperature = 55° Celsius: 1-3, Temperature = 56° Celsius: 4-5, Temperature = 57° Celsius: 777-789, Temperature = 58° Celsius: 6-6,776-776,790-791, Temperature = 59° Celsius: 7-48,302-312,773-775,792-792, Temperature = 60° Celsius: 49-138,297-301,313-314,771-772, Temperature = 61° Celsius: 139-296,315-316,654-770,793-851 Temperature = 62° Celsius: 317-653, This sequence should be run at all of the following temperatures to ensure detection of all polymorphisms. Recommended temperature: 62° Recommended temperature: 56° http://insertion.stanford.edu/melt.html

DHPLC CBP Exon 6 A. Rothan’dan

DHPLC A. Rothan’dan

DHPLC A. Rothan’dan

DHPLC Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.

DHPLC

DHPLC DHPLC = denaturing high-performance liquid chromatography. Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002;306:63-73.

Karıştırma testi DHPLC P300/EXON16 4239G->T E1014X

Karıştırma testi DHPLC CBP/EXON31.1 5371-8INSA

DHPLC HDAC2 EXON1 Karıştırma

HDAC2 143InsCAG

DHPLC HDAC2 EXON12 Karıştırma

HDAC2 1573DelA HCT15

HSUV39H2 -11InsA (?) SSCP

Kapiller Elektroforez

Genel Primerlerle işaretleme

P300 4239G>T (E1014X)

P300 4239G>T (E1014X )

CBP IVS21-4del22

CBP IVS21-4del22

CBP IVS31-7InsA

CBP IVS31-7InsA

TGCE Temperature Gradient Capillary Electrophoresis http://www.spectrumedix.com/7144_9155163437/blank/browse.asp?a=383&BMDRN=2000&BCOB=0&c=53494

Mutasyon Analiz Teknikleri III Hafta IX PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri III Prof. Dr. Hilâl Özdağ

Bir sonraki aşama…. 1. SSCP, HA, DHPLC, TGCE benzeri bir teknikle saptadığınız ve incelediğiniz DNA fragmentinde konformasyonel değişime neden olan dizi değişiminin ne olduğunu ortaya çıkarmak, 2. İncelediğiniz DNA fragmentini bir indirekt yöntemle analiz etmeden doğrudan dizi bazında değerlendirmek, 3. Klonlamak üzere hazırladığınız DNA fragmentine klonlama öncesi aşamalarda (PCR) hatalı bir baz girip girmediğinden emin olmak için Bir sonraki aşama DNA dizi analizidir.

DNA DİZİ ANALİZİ

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ MUTASYONU ÖNCEDEN BİLİYOR VE YENİ BİR ÖRNEK GRUBUNDA VARLIĞINI SORGULAMAK İSTİYORSANIZ RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) ASA (Allele Specific Amplification) Primer Extension

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ RFLP Yabanıl Tip Allel AGATCT TCTAGA RE kesim bölgesi Mutant allel AGAGCT TCTCGA RE bölgesi kaybolmuş

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ ASA

Primere bir nt eklenmesi Primer Extension : Saptama: Floresans Bağlanma: Primere bir nt eklenmesi Uzama:

Primer Extension :