EMBRİYO SEÇİMİNDE ARRAY CGH Doç. Dr. Eray ÇALIŞKAN Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tüp Bebek Merkezi - Kök Hücre ve Gen Tedavileri Merkezi – Genetik Ar-Ge Laboratuvarı

Preimplantasyon Genetik Tarama: Neden? Embriyoların implante olup yaşayamamasının 50% nedeni anöploidi Anöploidilerin 70%’i oositin ilk mayoz bölünmesi sırasında oluşur İyi morfolojisi olan blastokistlerin %30’unda anöploidi vardır

Preimplantasyon Genetik Tarama: Neden? Embryo seçimi; morfolojik özellikler Daha iyi morfolojisi olan embriyolar daha fazla implante olurlar: yine de %20-30 Morfolojik olarak iyi kabul edilen embriyolarda anöploidi oranı 30-40%’dır: Başarısız embriyo implantasyonu, Düşük Trizomik bebek doğumu Munne et al., RBM online, 2003

FISH TABANLI TECRUBE RKÇ’lar PGT’nın implantasyon oranı veya eve canlı bebek götürme oranını arttırmadığını göstermiştir Staessen et al 2004, 2008; Mastenbroek 2007; Hardarson 2008; Meyer et al 2008; Debrock 2009) ANCAK, FISH ilk jenerasyon teknolojidir 8 kromozom FISH – yüksek yanlış negatiflik 27% Merkezlerin embriyo biyopsisi tecrübesi? Kutup cisimciği, 3. gün, blastokist Johnson et al, Hum Reprod, 2010

FISH TANISINDA YANLIŞ POZİTİFLİK Eğer FISH tanısı monozomi ise embriyoların 65%’i array CGH ile öploid bulunmuştur Eğer FISH tanısı trisomi ise embriyoların 47%’si array CGH ile öploid Eğer FISH tanısı kompleks anöploid ise embriyoların 63%’ü array CGH ile öploid Northrop et al, Hum Reprod, 2010

FISH teknolojisi Array CGH FISH ile prob başına 2-3% allel dropout hızı 6 prob ile yanlış tanı hızı %12-18 8 prob ile yanlış tanı hızı %16-24 Allel dropout problemi Tüm yanlış tanı oranı 2% Bir allelin rastgele kaybı Fazla amplifikasyon Az amplifikasyon Handyside 2004, Rendwick 2006, Spits 2006, Glentis 2009

51% SPONTAN DÜŞÜK DATASI Bulgu FREKANS 45,X 18 Triploidi 17 Trisomi 16 16.4 Trisomi 22 5.7 Trisomi 21 4.7 Trisomi 15 4.2 Trisomi 13 3.7 Trisomi 18 3 Diğer trizomiler 14.3 Tetraploidi 6 Dengesiz translokasyonlar Diğer 4 51%

PREIMPLANTASYON GENETİK TARAMA Kendiliğinden düşüklerde en sık rastlanan genetik anormallikler Triploidi Monosomi X Trizomi 16 Trizomi 22 Tetraploidi Trizomi 15 Trizomi 21 FISH analizi ile sık tarananlar 13,18,21, X, Y – 14, 12 Tanı oranı 51%-%16 YTO

İN VİTRO YAŞAM? Düşüklerin analizi veya yaşayan anöploidiler transfer öncesi embriyolar hakkında çok az bilgi veriyor. Bazı anomaliler implante olabiliyor AMA Hiç implante olmayan veya daha düşük oranda implante olanlar? Bazı kromozomların anöploidiye daya yatkın oldukları dogması doğru mu?

2136 embriyo testi – Mark Hughes’un izniyle

224 embriyo testi – TÜMGEN-Kocaeli University Experience 8 probe FISH 45% Detection Rate Drop-out %16-24

GENETIK METHODLAR PCR – Polimeraz zincir reaksiyonu Amplification of genes interested FISH – Floresan in situ hibridizasyon Kromozoma özgü bazı gen bölgelerini farklı renkteki Florockromlarla işaretlemek CGH array Oligonükleotid \ BAC array ile tüm genin taranması

46,XY,t(7;13)(q22;q12) q22- q12-

SNP

ARRAY CGH NEDİR? VE ne değildir?

BACArray OligoArray 44k = 44.000 prob 44.000 X 65bp =2.860.000bp 2.860.000 = 3MB Genome = 3.000.000.000 Tüm genomun 1/1000’ini tarar BACArray Tüm genomun 1/3000’ini tarar

Kalite Kontrolü ve Data analizi Hasta DNA’sı Kontrol DNA Cy3 işaretlemesi Cy5 işaretlemesi Ko-Hibridizasyon Yıkama ve tarama Kalite Kontrolü ve Data analizi

CONTROL TEST 1.0 1.5 0.5

CONTROL TEST 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5

CONTROL TEST 1.0 1.5 0.5

kutup cisimciği blastomere blastokist reciprokal translokasyon TÜMGEN®

KUTUP CİSİMCİĞİ BİYOPSİSİ

Öploid

-16

+22

+15,-22

KARMAŞIK ANÖPLOİD

KARMAŞIK ANÖPLOİD

ARDIŞIK KUTUP CİSİMCİĞİ VE OOSİT VERİSİ Kocaeli Üniversitesi-TÜMGEN ® & Cambridge University-BlueGnome ®

Kutup Cisimciği 1 - öploid

Kutup Cisimciği 2 - öploid

Oosit - Öploid

Kutup Cisimciği 1

Kutup Cisimciği 2

KC 1 A - +15,

KC2 A - -2, -5, -9, -15, -21

Oosit A - +2, +5, +9, +15, +21

BLASTOMER ANALİZİ

Blastomer tek hücre- öploid

Blastomer tek hücre- anöploid

BLASTOKİST ANALİZİ

FISH SONUCU = Monozomi 17 11 Kutup Cisimciği 1 İç Hücre Kitlesi 12

KC 1 Blastokist IHK 1

Öploid Trofoektoderm hücresi

Karmaşık Anöploidi Trofoektoderm hücresi

RESİPROKAL TRANSLOKASYON

t(3:11)

t(2;22)

t(2;22)

-chr2

Dengesiz translokasyonlar t(2;22)(p12;11.22)

12 saat içinde sonuç -8p, -15

Kromozom görüntüsü -8p

12 saat içinde sonuç +8p, +22

Kromozom görüntüsü +8p

Lokus Analizi– Hastalıkların kontrolü

Embriyo seçiminde Array CGH in Klinik kullanımı Kopya sayısındaki değişkenlikleri tanımlar Konvensiyonel metodların sağlamasını yapar Anöploidi tanısında yararlıdır Delesyon ve dublikasyonları tanır Uniparental dizomi tanısını SNP temelli olarak yapar

Embriyo seçiminde Array CGH in Klinik kullanımı Klasik karyotipleme ile %100 uyumludur %10-30 ekstra bilgi sağlar

ArrayCGH Avantajları Yüksek duyarlılık Tek hücre yeterli Hızlı sonuç Zamanda rahatlık Sonuçlar daha sonra tekrar çalışılabilir Başka metodlarla doğrulanabilir

Array CGH’in kısıtlamaları Bazı dengeli translokasyonları atlayabilir Hala pahalı ama gittikçe ucuzluyor Yüksek çözünürlüklü tarayıcılara ihtiyaç vardır Üretici, dağıtıcı ve testi yapabilenler az sayıda

MOZAİK EMBRİYOLAR Önce trofoektoderm sonra İHK biyopsisi yapılınca 42.3% tüm hücreler öploid 30% tüm hücreler anöploid 32.4% si mozaik 15.4% karışık farklı hücre dizilerinden oluşan anöploidiler, 17% hem normal hem anöploid hücreler var. Mozaik diploid– Toplamın %6’sında yani anöploid blastokistlerin %30 unda normal öploid iç hücre kütlesi var

Embriyo seçiminde array CGH kullanan Klinik Çalışma Sonuçları Embriyo Grade ‘i Öploid 111 222 33 1.5 Mozaik öploid 11111 2222222 333 1.9 Kaotik anöploid 11 222 333 1.7 Anöploid 1111 2222 333 2.2 Segment hataları 111111 222 3 1.4 Johnson et al, Hum Reprod, 2010

Dengeli translokasyonlara bağlı tekrarlayan düşüğü olanlarda 28 çift 228 embriyo testi Test edilen embriyoların 16 % sı genetik olarak normal ET başına devam eden gebelik oranı 72% Fiorentino et al, Hum Reprod, 2011

2008 -2011 KUTUP CİSİMCİĞİ VEYA BLASTOMER BİYOPSİSİ Vakalar 82 Hibridizasyon 224 Anöploid embriyo oranı %68 Öploid embriyo oranı %32 Tüm embriyoları öploid olan hasta 0% Tüm test edilen embriyoları anöploid olan hasta sayısı %19.5 (n=16)

GEBELİK SONUÇLARI Vakaların ortanca yaşı 41 (35-44) Daha önce 3 IVF başarısızlığı n= 21 PR PET: 27% Parental translokasyonlar with RPL n= 15 PR PET: 58% Anne yaşı 40 ve üzeri n= 23 PR PET: 32% Vakaların ortanca yaşı 31 ( 26-34) Elektif= 23 PR PET: 61%

SONUÇ Array CGH uygulamaları sonucunda PGT için yeni bir dönem başlamıştır Gelecekteki teknolojik gelişmeler array CGH uygulamalarını daha da geliştirecektir

TÜMGEN® TEKNOPARK ‘ARRAYLAND’ KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ TÜP BEBEK MERKEZİ KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ GENETİK ANABİLİMDALI TÜMGEN® TEKNOPARK ‘ARRAYLAND’