ERKEK İNFERTİLİTESİ VE TEMEL SEMEN ANALİZİ PROF.DR.SERDAR GÜNALP H.Ü.T.F KADIN HAST. VE DOĞUM ANABİLİM DALI ÜREME ENDOKRİNOLOJİSİ İNFERTİLİTE VE ANDROLOJİ ÜNİTESİ

Spermatogonyum Olgun spermatozooa SPERMATOGENEZ Spermatogonyum Olgun spermatozooa 3 fazda olaylanır (70 gün) Spermatositogenez (Proliferatif/mitotik faz) Spermatogonyum Primer spermatosit Mayotik faz Diploid primer spermatosit Haploid sekonder spermatid Spermiyogenezis Spermatid Spermatozooa

SPERMATOGENEZİS

NORMAL FİZYOLOJİ Erişkin bir erkek günde ortalama 100-200 milyon sperm üretmektedir Bir erkek yaşamı boyunca 1500-2000 milyar spermatozoa üretir. Reprodüktif yaşdaki erkeklerin %6’sında infertilite problemi vardır. Bunların %90’ında da bozulmuş spermatogenez görülür.

İNFERTİLİTE NEDENLERİ Erkeğe ait Kadına ait Tübo-peritoneal Ovulatuar Uterin Erkek ve kadına ait Açıklanamayan % 30-40 40-50 25-30 15-20 5-10 20-25 10-15

İNFERTİL ÇİFTLER ARASINDA ERKEK FAKTÖRÜNÜN TANISAL DAĞILIMI (%)- 7057 Gösterilebilen bir neden yok Seksüel faktör Enfeksiyöz nedenler Konj. faktörler Varikosel (+An. semen.) Diğer akkiz nedenler Endokrin bozukluklar İmmünolojik faktör İdiopatik anormal semen. Oligozoospermia Asthenozoospermia Teratozoospermia Diğer nedenler FARLEY & BELSEY - 1988 48.5 1.7 6.6 2.1 12.3 2.6 0.6 3.1 26.4 12 4 7 3

7802 ERKEK DE TANISAL DAĞILIM (%) BEHRE-1994 31.7 16.6 8.9 9.0 8.5 5.7 5.0 4.2 2.3 1.5 6.6 İDİOPATİK İNFERTİLİTE VARİKOSEL ENDOKRİN HİPOGONADİZM ENFEKSİYON İNMEMİŞ TESTİS EJAKÜLATUAR/EREKTİL DİSFONK. GENEL HASTALIKLAR SPERM ANTİKORLARI TESTİS TÜMÖRLERİ OBSTRÜKSİYON DİĞER

ERKEK FAKTÖRÜNDE TEMEL NEDENLER Hipotalamik hipofizer hastalık (sekonder hipogonadizm) (%1-2) Testiküler hastalık (primer hipogonadizm) (%30-40) Post-testiküler nedenler (sperm transport bozuklukları) (%10-20) Sınıflandırılamayanlar (%40-50) de Kretser, DM. Male Infertility. Lancet 1997; 349:787.

TEDAVİ EDİLEBİLİR NEDENLER Erkek infertil olguların %30’unda tedavi edilebilir nedenler saptanır. Hipogonadizm Varikosel Enfeksiyonlar İmmünolojik infertilite Obstrüksiyonlar Olguların çoğunda neden gösterilemez ve idiopatik oligoastenoteratozoospermi olarak tanı alır. Irvine DS 1998 Epidemiology and aetiology of male infertility. Human Reproduction 13 (Suppl. 1), 33–44. Isidori A, Latini M, Romanelli F 2005a Treatment of male infertility. Contraception 72, 314–318.

ERKEK İNFERTİLİTESİNDE TEMEL DEĞERLENDİRME Hikaye Fizik muayene Standart Semen analizi Özel semen testleri Genetik testler Endokrin testler

SEMEN ANALİZİ-ÖNEM DOĞRU, DÜZGÜN VE BECERİ İLE YAPILAN BİR SEMEN ANALİZİNDEN ELDE EDİLECEK BULGULAR ERKEK İNFERTİLİTESİNİN SADECE İLK DEĞERLENDİRİLMESİ İLE KALMAYIP TANI VE TEDAVİDE DE BİZE ÇOK KIYMETLİ BİLGİLER VEREBİLİR.

Şekil 2.1. 120 haftaya kadar iki haftada bir erkeğin semenindeki sperm konsantrasyonun gösteren şema. Bu süre boyunca hasta medikasyon almamış ve ateşli hastalık geçirmemiştir. Kesikli çizgi 20x106 /ml gösterir. Bu Data, bazı erkeklerin sperm konsanstrasyonlarındaki çeşitliliği gösterir. (C.Paulsen’den yayınlanmamış data)

DEĞERLENDİRME ÖNCESİ BİLİNMESİ GEREKLİ BİLGİLER EJAKÜLATIN ELDESİ HASTANE İÇİNDE İYİ DONATILMIŞ BİR ORTAMDA MASTURBASYON İLE ÖNERİLİR ÖZEL PREZERVATİF OLABİLİR (Silastic) Latex olmamalıdır.(Motiliteyi bozar) KOİTUS İNTERRUPTUS ÖNERİLMEZ. Split ejakülat elde edilemez EJAKÜLATIN TAŞINMASI 60-100 ml’LİK GENİŞ AĞIZLI, STERİL VE POLİPROPİLENDEN YAPILMIŞ , AĞZI VİDALI KAPAKLI PLASTİK KAP (Polistyrene=viskoziteyi arttırır )

DEĞERLENDİRME ÖNCESİ BİLİNMESİ GEREKLİ BİLGİLER CİNSEL YOKSUNLUK/PERHİZ 3-4 GÜN ÖNERİLMEKTEDİR DEĞERLENDİRME ŞARTLARINI STANDARDİZE EDER DEĞERLENDİRMELER ARASI DEĞİŞKENLİK EN AZA İNDİRGENMİŞ OLUR. ÖRNEK VERİLDİKTEN SONRA DEĞERLENDİRMEYE KADAR 37° C İNKÜBATÖRDE LİKEFİYE OLANA KADAR BEKLETİLİR.

BU 4 GRUP BİRBİRLERİ İLE BAĞLANTILI OLARAK DEĞERLENDİRİLİR SEMEN ANALİZİ HASTANIN DETAYLI HİKAYESİ VE FİZİK MUAYENESİ KANTİTATİF VE KALİTATİF ANALİZLER BİOKİMYASAL ANALİZ TARAMA TESTLERİ BU 4 GRUP BİRBİRLERİ İLE BAĞLANTILI OLARAK DEĞERLENDİRİLİR

TANISAL TESTLER Uzun yıllardan beri androloglar için geçerli tek analitik yöntem semen kalitesinin tanımlayıcı analizi idi.* Sayı Motilite Morfoloji Lökositospermi *MACLEOD AND GOLD 1952

STANDART YÖNTEMLER İlk makroskopik değerlendirme Likefaksiyon (15 dk.-Oda ısısı.) Görünüm (Homojen, gri-opak) Volüm (2 ml) Viskozite (2 cm) pH (6.4-8.0) 7.2 İlk mikroskopik değerlendirme Konsantrasyon (20x106 /ml) Motilite (%50 a+b) Agglütinasyon (İmm) Sperm dışı hücresel elemanların varlığı (Yuvarlak hücreler) (Lök.<1x06/ml)

STANDART YÖNTEMLER Sonraki mikroskopik değerlendirme Sperm vitalitesi –Eozin Y (%1)boyası ile (PHS%<%30) Sperm morfolojisinin değerlendirilmesi Sperm morfolojisinin sınıflandırılması Baş / Boyun-ortakısım /kuyruk / Stoplazmik artık Antikor ile kaplı sperm değerlendirilmesi ( 200 motile sperm.) İmmünobead test ( >%50 mot.sp) Mixed antiglobulin reaction test (MAR)

FİZİKSEL PARAMETRELER (SEMEN ÖRNEĞİNİN GÖRÜNÜMÜNÜ TANIMLAYAN PARAMETRELER) KOAGÜLASYON* LİKEFAKSİYON* VİSKOZİTE* VOLÜM RENK* KOKU* Ph*

FİZİKSEL PARAMETRELER-I KOAGÜLASYON:Ejakülasyon sonrası semenin sıvı halden semisolid hale seminal vezikülden yapılan protein kinaze enzimi ile geçmesidir. Koag. olmadığında seminal vezikül ve vas deferensin yokluğundan şüphelenilir. LİKEFAKSİYON:Koagüle olan semen 10-20 dk içinde likefiye olur.Bu süreç prostatdan yapılan proteolitik bir enzim olam fibrinolizinle olur.Bu nedenle likefaksiyon normal prostat işlevinin bir göstergesidir.

FİZİKSEL PARAMETRELER-II VİSKOZİTE:Likefiye olan semenden bir pipet ile damla yöntemiyle ölçülür. Pipete çekilen semen damlatılarak oluşan iplikçiğin boyu ölçülür. 20 mm’ye kadar normaldir 20-40 mm. Arası hafifçe artmış 40-80 mm. Arası oldukça artmış 80 mm. Üstü ise çok artmıştır Artmış viskozite genital traktusda , prostatda veya seminal vezikülde olan bir enfeksiyonu gösterir. Uygunsuz plastik kap kullanımı,sık ejakülasyon da viskozitede bir artış nedeni olabilir. Likefaksiyon süresinin uzaması ile artmış viskozite karışabilir. (Non-homojen / Homojen-yapışkan)

FİZİKSEL PARAMETRELER-III VOLÜM:3-5 günlük cinsel yoksunluk sonrası 2-6 ml.’dir. (1 gr.=1ml) Az Volüm: Obstr. (geç.enf.);Konj.abs.vas deferens/VS.;Retr.Ej. RENK:Gri opak renktedir.Cinsel yoksunluk süresi artarsa sarımsı renge dönüşür. Konsantrasyon düşerse renk açık/sulu şekle döner,artarsa bulanıklık artar. AB.ler rengi etkileyebilir. KOKU:Prostat sekresyonu olan sperminin oksidasyonu ile olur.Atkestanesi ağacı çiçeği kokusuna benzetilir. Normalden sapması enfeksiyon göstergesidir. Uzun perhiz pH: 7.2-7.8 arası dağılım normal kabul edilir. (Lik.sonrası ölçülür.) Akut Enf.’da yükselir.Kr.enf’da düşer.

İLK DEĞERLENDİRME FAZ - KONTRAST MİK. İLE YAPILIR LOW-POWER FİELD (100-150 X) MAR TEST / VİTALİTE (DÜŞÜK MOT.) HIGH –POWER FIELD (400 X) ÖRNEK DİLÜSYONU/MORF. AGGLÜTİNASYON Aggregasyon: Non-motil spermlerin kümeleşmesi Spesifik agglütinasyon:Antikora bağlı.Motil spermlerde gözlenir.

EJAKÜLATI OLUŞTURAN SEKRESYONLARIN % OLARAK DAĞILIMI SEKRESYON YERİ % EJAKÜLAT TESTİSLER 5 (0.2 ml) SEMİNAL VEZİKÜL 45-80 PROSTAT 13-33 BULBO-URETRAL ve 2-5 URETRAL BEZ

ANDROLOJİDE SEMENDEKİ NORMALDEN SAPMALARI TANIMLAYAN TERMİNOLOJİ-I -spermia Aspermia Hematospermia Lökositospermia Hipospermia Hiperspermia -zoospermia Azoospermia Normozoospermia Ejakülat ile ilgili Ejakülatın olmaması Ejakülatta kan olması Ejakülatta BK olması Ejakülat volümü <1 ml. Ejakülat volümü >6 ml. Ejak.daki sperm ile ilgili Ejakülatta sperm olmaması Normal semen parametreleri

ANDROLOJİDE SEMENDEKİ NORMALDEN SAPMALARI TANIMLAYAN TERMİNOLOJİ-II Oligozoospermia Polizoospermia Asthenozoo-spermia Teratozoospermia Nekrozoospermia Globozoospermia <20 x 106 sperm /ml >250 x 106 sperm /ml Zayıf motilite ve/veya ileri doğru hareketlilik. Normal şekilli sperm yüzdesinin azalmış olması (< %14 Kruger) Supravital boyama ile tüm spermlerin ölü olması Yuvarlak başlı akrozomsuz sperm

KANTİTATİF VE KALİTATİF ANALİZLER X MOTİLİTE ve İLERİ DOĞRU HAREKET ETME KAPASİTESİ KONSANTRASYON MORFOLOJİ SUPRAVİTAL BOYAMA. X Bu değerlendirmeler likefaksiyonun tamamlanması ve ejakülatın iyice karıştırılarak homojen bir hale getirilmesinden sonra yapılmalıdır.

MOTİLİTE DEĞERLENDİRİLMESİ GRADE A: İleri doğru hızlı hareketlilik GRADE B: İleri doğru yavaş/tembel hareketlilik GRADE C: İleri doğru olmayan yerinde hareketlilik GRADE D: Hareketsizlik/ İmmotilite. Sperm motilitesi kadın genital traktüsünden ve fertilizasyon sırasında granüloza hücreleri arasından geçişde ve ZP penetrasyonunda çok önemlidir.

MOTİLİTE DEĞERLENDİRİLMESİ GRADE A: > 25 µm/sn 37°C : > 20 µm/sn 20°C GRADE B: 5-25 µm/sn 20-37 °C GRADE C: < 5 µm/sn 20- 37°C GRADE D: Hareketsizlik/ İmmotilite. .

DÜŞÜK MOTİLİTE NEDENLER Yanlış örnek verme ve transport. Yapısal anomaliler:Mid-piece / Kısa kuyruk Kartagener sendromu. Genital kanaldan geçerken olan toksik etkiler. Enfeksiyonlar. Varikosel/Kromozomal nedenler/ metal ionları. Antikor

SPERM KONSANTRASYONU Sperm sayısı erkek infertilitesinde dolaylı ve hassas olmayan bir göstergedir. Düşük sperm sayısı spermatogenezde sıklıkla altta yatan bir hatayı gösterir Fertilite, sperm sayısı <5 x 106 /ml. önemli ölçüde etkilenmektedir Sperm sayısı, sperm yapımı ve seminal plazma volümünden etkilenir. Enfeksiyon, ejakülasyon sıklığı. Bölgesel varyasyonlar: Lokal /Çevresel /Genetik

KONSANTRASYON MAKLER SAYIM KAMERASI Özel olarak yapılmış, pahalı bir alettir Dilusyon gerektirmez (Avantaj) Üst kapak ile lam arasında 10 m ’luk sadece tek bir spermin yüzebileceği bir alan vardır 1 mm2’lik alan 100 küçük kareye bölünmüş olup bu küçük karenin alanı 0.01 mm2’dir 10 küçük kare 10 m’luk derinlik ile çarpıldığında 0.001 mm3 deki yani 1 ml’nin 1/1 000 000 deki sperm sayısı bulunur Özetle 10 kk’de sayılan sperm önüne 106 eklenerek 1 ml.’deki sayı hesaplanır

MAKLER SAYIM KAMERASI

MAKLER YAN KESİT

MAKLER UYGULAMA

MAKLER MİK.GÖRÜNÜM 20 X BÜYÜTME

POLYZOOSPERMİA 1.2x109 / ml.** Ejakülat süt beyazı renginde (Bu güne kadar sayılmış en yüksek sperm sayısı) **İNTERPRETATION OF SEMEN ANALYSIS RESULTS A PRACTİCAL GUİDE RAJASINGAM S. JEYENDRAN S:42

MORFOLOJİ KRUGER’S STRİCT CRİTERİA İYİ BELİRLENMİŞ BİOLOJİK PRENSİPLER ÜZERİNE KURULU BİR DEĞERLENDİRMEDİR . FERTİLİZASYON VE FERTİLİZASYON SÜRECİNİ BELİRLEMEDE GÜVENİLİR BİR KRİTERDİR W.H.O. DEĞERLENDİRMESİNDEN FARKI SPERMİ BİR BÜTÜN OLARAK ELE ALMASI VE ŞÜPHELİ ŞEKİLLERİ ANORMAL DEĞERLENDİRMESİDİR.

MORFOLOJİ ve FERTİLİZASYON ORANLARI (IVF) MORFOLOJİ % N >15 <14 14-5 <4 FERTİLİZASYON % 82.5 % 37 % 64 (G-pattern) % 7.6 (P-pattern) SPERM KONSANTRASYONU > 20X106 / ml MOTİLİTE > %30 (WHO)

MORFOLOJİ HAZIRLAMA Slide’lar iyice temizlenir.Alkolle silinip havada kurutulur. Normal konsantrasyonlarda 10 µl damla ile yayma yapılır. Yaymanın kalınlığı açı ve hız ile ayarlanabilir. İyi bir yaymada büyük büyütmede her alanda 5-10 sperm olmalıdır. Boya olarak Spermac;Diff-Quik;Mod.Papanic. Kullanılır. İncelemede en az 200 sperm bakılmalıdır.

NORMAL SPERM MORFOLOJİSİ Baş düzgün oval şekildedir Akrozom başın apikal (ön) kısmının %40-70’ini kaplar Başın en ve boy olarak ölçümleri kullanılan boyaya göre değişmesine rağmen ortalama 4-6μ x 2.5-3.5μ’dur Orta kısım başın tam alt ortasından axial olarak birleşir ve silindir şeklinde olup eni < 1μ boyu ise baş uzunluğunun 1.5 katıdır. (6-10μ)

NORMAL SPERM MORFOLOJİSİ Stoplazmik droplet (artık) ise sadece orta kısımda olmalı ve başın oluşturduğu alanın yarısından fazlasını kaplamamalıdır. Kuyruk ise düzgün ve orta kısımdan biraz daha ince olmak üzere, kırılmamış ve kıvrıklaşmamış ve yaklaşık 45μ uzunluğundadır. Sınırda , şüpheli şekiller (Borderline ) anormal kabul edilir.

SPERMAC BOYASI a: akrozom e: ekvatoryal bölge p: post-akrozomal bölge m: midpiece t: tail / kuyruk. SPERMAC BOYASI Midpiece ile Kuyruğun birleşme Bölgesi.

AKROZOM BAŞ ÇEKİRDEK ORTA KISIM ESAS KISIM KUYRUK UÇ KISIM 3 µm 5 µm

NORMAL SPERMATOZOA DIFF QUIK BOYASI

NORMAL SPERMATOZOA

SPERM ANOMALİLERİ BAŞ ANOMALİLERİ DİĞER ANOMALİLER AMORF / ŞEKİLSİZ BÜYÜK / MEGALO KÜÇÜK / MİKRO UZAMIŞ/ELONGATED ÇİFT BAŞ DİĞER ANOMALİLER PREKÜRSÖRLER STOPLAZMİK ARTIK KOPUK BAŞ KUYRUK DEFEKTİ

SPERM MORFOLOJİSİ VE KLASİK IVF - SONUÇ Araştırmaların %92’sinde sperm morfolojisi ile IVF’de başarı arasında pozitif korelasyon saptanmıştır. REF:Coetzee et al. HR Update 98:4:73

MORFOLOJİK ANOMALİ TİPİ ICSI BAŞARISI ETKİSİ VAR: GLOBOZOOSPERMİA (SAOAF) AMORF BAŞ / UFAK AKROZOM FR EMBRİO KALİTESİ BAŞ /KUYRUK BİRLEŞME DEFEKTLERİ Sentriol disf. Yetersiz aster oluşumu MAKROSEFALİ / ÇOK KUYRUK Krom. Anormallik / anoploidi ŞİDDETLİ UZAMIŞ BAŞ ŞEKLİ İnkomplet dekondensasyon.

SPERM KAYNAĞI VE ICSI BAŞARISI Ejakülat, Epididimal, Obstruktif testiküler spermde Fertilizasyon oranı, Gebelik oranları Non-obstruktif testiküler sperme göre daha iyi; Ancak, Devam eden gebelik oranları (>12 hafta) fark yok. Tavmergen Goker E, 2003; Aboulghar MA, 1997

HİPO OSMOTİK ŞİŞME TESTİ (HOS TEST) İNTAKT HÜCRE ZARININ YARI GEÇİRGENLİĞİ ÜZERİNE KURULMUŞTUR. HİPOOSMOTİK ORTAMDA HÜCRE İÇİNE SU AKIMI OLUR VE HÜCRE ŞİŞER. SPERM MEMBRANININ FİZYOLOJİK BÜTÜNLÜĞÜNÜ TEST EDER. BİR ÇEŞİT SPERM VİTALİTE TESTİ OLARAK DA KULLANILIR DEĞERLENDİRMEDE 100 SPERM SAYILIR %60 ve ÜSTÜ NORMALDİR.

HOS TEST ŞEKİL

SUPRA-VİTAL BOYAMA HAREKETSİZ SPERMİN CANLI OLUP OLMADIĞI ANCAK BU ŞEKİLDE ANLAŞILABİLİR EOZİN-NİGROZİN BOYASI İLE DEĞERLENDİRME YAPILIR , BASİT VE UCUZDUR BİR DAMLA SEMEN ÜZERİNE %1’LİK EOZİNDEN 1 DAMLA 30 sn. SONRA %10’LUK NİGROZİN’DEN 2 DAMLA KONUR KARIŞIM TEMİZ BİR LAM ÜZERİNE YAYILIR VE KURUTULUR. 1OO X BÜYÜTMEDE 100-200 SPERM SAYILIR, BOYA ALANLAR CANSIZDIR %75 ÜSTÜ NORMALDİR

TARAMA TESTLERİ MAR / IBD TEST- ASA (%50 den fazlası patolojik) KREMER TEST -İn vitro sperm penetrasyon testi. (Spermin kapiller tüpdeki sx.mukus kolonuna penetre olma yeteneğini ölçer) PEROKSİDAZ TEST / LÖKOSİT PMN-Elastaz. FRUKTOZ DEĞERLENDİRMESİ Vesiküla sem./Vas deferens yokluğu Nötral α-GLUKOZİDAZ :Epididim obstrüksüyonu.

SEMEN ANALİZİ BİOKİMYASAL DEĞERLER -Glukozidaz (nötral) Çinko (Total) Sitrik asit (Total) Asit fosfataz (Total) Fruktoz (Total) > 20 mU / Ejakülat > 2.4 mmol / Ejakülat > 52 mmol / Ejakülat > 200 U / Ejakülat > 13 mmol / Elakülat

AZOOSPERMİ TANISI Örnek 3000 g. de 10 dk süre ile çevrilir. Süpernatan atılıp pellet medium ile resüspende edilip mikroskopda bakılır. Sperm yok ise : Gerçek azoospermi Tek, tük sperm var: Kriptozoospermia. (Severe oligozoospermia)= <1x106 /ml

SEMENE AİT DEĞİŞKENLERİN REFERANS DEĞERLERİ-I* Volüm : 2.0 ml veya fazlası pH : 7.2 veya daha fazla Sperm kons. : 20x106 sperm/ml veya daha fazla Total sperm sayısı : 40x106 sperm/ejakülat veya daha fazla Hareketlilik : Ejakülasyondan sonra 6O dk. İçinde %50’den fazla grade a+b veya %25’den fazla grade a tipi hareketli sperm olması

SEMENE AİT DEĞİŞKENLERİN REFERANS DEĞERLERİ-II* Morfoloji : *** Vitalite: %75 veya daha fazlası canlı (Boya almayan) Lökosit: 1x106 /ml’den az Immunobead testi : Motil spermlerin %50’den azı ımmunbead’lerle bağlı MAR test : Motil spermlerin %50’den azında partiküller yapışık

SEMENE AİT DEĞİŞKENLERİN REFERANS DEĞERLERİ-III* ***Morfoloji Bu el kitabında verilen morfoloji değerlendirme yöntemlerini kullanan çok merkezli popülasyona dayalı çalışmalar halen devam etmektedir. Yardımcı üreme programlarından elde edilen bilgiler, bu el kitabındaki yöntem ve tarifler kullanılarak yapılan değerlendirmelerde sperm morfolojisinin %15 normalin altına düştüğü durumlarda in vitro fertilizasyon oranının da düştüğünü göstermektedir. *WHO: Laboratuvar El Kitabı, İnsan semeni ve sperm-servikal mukus etkileşimi değerlendirilmesi s: 60 4TH ED. 1999

YORUMLAR Sonuçlar üzerine etkili olabilecek tüm faktörler bilinmeden semen analizi tam olarak yorumlanamaz. Grip veya geçirilen viral ateşli hastalıklar parametreleri etkiler. Mevsimsel değişiklikler spekülatifdir Yoksunluk süresi ile sayı ve mot. değişir. Anormal çıkan sonuçları kesinleştirmek için 3-5 hafta arayla en az 3 kez değerlendirme yapılmalıdır.

MOTHER NATURE HAS DONE HER JOB FOR MILLIONS OF YEARS, whereas, WE STARTED TO MIMICK HER JOB RATHER RECENTLY. THERE ARE MANY THINGS WE STILL HAVE TO LEARN FROM THE NATURE.... R. YANAGIMACHI, 1988

Teşekkürler