LABORATUAR ÖLÇÜM METODLARI VE ANALİZ YÖNTEMLERİ, SPEKTROFOTOMETRİ

Ölçüm, bir uzunluğun, bir alanın, bir kapasitenin veya herhangi bir olgunun belirli bir birim cinsinden hesaplanmasıdır. Bunun için standart ölçü birimleri kullanılır. Ölçü birimleri, iki farklı sistemde farklı olarak belirtilmiştir: 1- metrik sistem 2- SI sistem (uluslararası sistem)

1- Metrik sistem uzunluk birimi= metre kütle birimi= gram hacim birimi= litre

2- SI sistem Uzunluk = metre (m) Kütle= kilogram (kg) Konsantrasyon= mol (mol) Zaman= saniye (s) Elektrik akımı= amper (A) Isı= kelvin (K) Işık yoğunluğu= kandela (cd) Katalitik miktar= katal (kat)

Temel Birimlerin Küçülen Katlarının Önekleri Desi (d): 10-1 Santi (c): 10-2 Mili (m): 10-3 Mikro (µ): 10-6 Nano (n): 10-9 Pico (p): 10-12 Femto (f): 10-15 Atto (a): 10-18

Temel Birimlerin Büyüyen Katlarının Önekleri Deka (da): 101 Hecto (h): 102 Kilo (k): 103 Mega (M): 106 Giga (G): 109 Tera (T): 1012 Peta (P): 1015 Exa (T): 1018

Laboratuvarda en çok kullanılan çevrimler: 1 dl 10-1 l 10 dl 1 l 1 ml 10-3 l 1 ml 10-2 dl 100 ml 1 dl 1 μl 10-6 l 1000 μl 1 ml 1 mg 10-3 g 1000 mg 1 g 1 μg 10-6 g

Kullanılışlarına göre klinik biyokimyasal analizler 1) Rutin analizler. Sık kullanılan analizler 2) Acil analizler. Hemoglobin, kan grubu, hematokrit, KŞ, üre, kreatinin, sodyum, potasyum, klorür, kalsiyum, bilirubin, AST, ALT, CK-MB, Amilaz, Lipaz, CRP

Laboratuvar ölçüm metodları 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 2- iyon selektif elektrotlar (ISE) 3- türbidimetri 4- nefelometri 5- florometri 6- düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümü 7- elektroforez 8- kromotografi

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler Beyaz ışık farklı dalga boyu ve renklere sahiptir. Birbirini takip eden dalgaların aynı noktaları (örneğin tepe noktaları) arasındaki uzaklık dalga boyudur. Daha kısa aralıklı tepe noktaları daha kısa dalga boylarını ve ışığın daha fazla enerji içerdiğini gösterir.

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler Dalga boyu nanometre (nm=10-9 m)olarak ifade edilir. Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre farklı adlarla anılırlar: 180-380 nm ……….ultraviyole (UV) (mor ötesi) 380-750 nm ……….visible light (görünür) 750-….. nm ……….infrared (IR) (kızıl ötesi) Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler İşte, madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılırlar. Yani maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının tamamlayıcısı olan ışının rengidir.

Mavi-yeşil kırmızı 650-750 Yeşil-mavi Turuncu 595-650 Mavi Sarı 580-595 Kırmızı Yeşil 490-580 435-490 Sarı-yeşil Eflatun 390-435 Transmitte (yansıyan) edilen ışığın rengi Absorbe edilen ışığın rengi Dalgaboyu Solusyonun rengi, (görünen renk), Tamamlayıcı renk Tamamlayıcı renkler tablosu

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.1 kolorimetri: çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltinin renginden faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihaza kolorimetre denir. Ölçülecek çözeltinin rengi, değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırarak değerlendirilir.

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.2. fotometri: çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihazlara fotometre denir. Yani fotometreler, fotoelektrik kolorimetrelerdir. Fotometrelerde; ◊ hem ışığın tüm bölgelerinde (UV, görünür, IR) ölçüm yapılabilir, ◊ hem de renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz çözeltiler de ölçülebilir.

spektrofotometre Spektrofotometreler, maddenin renk yoğunluğunun ölçülmesiyle, madde miktarının veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır.

Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.

Bir madde, elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa (arbsorbluyorsa) siyah görünür. Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir made sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür. yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür.

İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UV-görünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon). Transmitte edilen renk o bileşiğin görünen rengini oluşturur. Transmitte ve absorbe edilen renkler birbirini tamamlar.

Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.

Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. I T = Io % T = x 100

Bir çözeltinin konsantrasyonu Absorbans (A) % transmittans Absorbans transmittansın negatif logaritmasıdır. Absorbans= optik dansite= A 1 I A= log = - logT = - log T Io

Lambert-Beer Kanunu Beer kanunu; Absorbans ve solüt konsantrasyonu arasındaki ilişkinin ifadesidir. Konsantrasyon arttıkça absorbans artar. Lambert kanunu; ışık yolu uzadıkça (solüsyonun derinliği arttıkça) absorbans artar. İkisi kombine edilerek bir eşitlik oluşturulmuştur.

A; absorbans (birimi yok) l; solüsyonun derinliği (cm) A = ε.l.c A; absorbans (birimi yok) l; solüsyonun derinliği (cm) c; konsantrasyon (mol/L) ε; molar absorbtivite (L.mol-1.cm-1) ε; molar absorbtivite: 1 cm’lik ışık yolunda 1 mol/L’lik solusyonun absorbans değeridir.

Spektrofotometrenin komponentleri; Işık kaynağı Giriş yarıklı levhası monokromatör Çıkış yarıklı levhası küvet detektör Spektrofotometrenin komponentleri; Tungsten lamba, civa ark, hidrojen ve döteryum lambaları Işık kaynağından çıkan dağınık ışıkları monokromatöre yönlendirir. Işık kaynağından gelen beyaz ışıktan uygun dalga boyunu seçip, diğerlerini elimine eder. Mercek veya prizma sistemidir Monokromatörden çıkan ışınlardan istenilen dalga boyundaki kısım geçirilir, diğerleri tutulur. Cam veya plastik numune okutma kaplarıdır. Küvetten geçen ışığın şiddetini ölçer.

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.3. otoanalizör: otoanalizör kabaca, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştıran, belirli süre ve ısıda inkübe eden, gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunan cihazlardır. Kısaca otomatik bir spektrofotometredir.

Bir otoanalizörün birim zamanda ( 1 saat) yapmış olduğu test sayısı önemlidir. Saatte onlarca hatta binlerce test yapan cihazlar vardır. bir hastanın acil çalışılması gerekirse, cihaza hasta serumu yüklendikten sonra, ACİL komutu verilerek öncelik acil hastasına verilebilir. numune ve reaktifin karıştırılıp, reaksiyonun gerçekleştiği küvetler ya tek kullanımlıktır ya da cihaz tarafından otomatik olarak yıkanıp tekrar tekrar kullanılır. kullanıcı sadece analizör üreticisi firmanın kitini kullanmak zorundadır.

otoanalizörlerde kullanılabilir dalga boyu sabittir ve üretici firma tarafından belirlenir. Kullanılabilir dalga boyu ne kadar genişse, o kadar iyi olur. otoanalizörde serum ve reaktif pipetleyen problar bir veya daha fazla olabilirler. Serum veya reaktif bulaşmasını önlemek için her pipetlemeden sonra, cihaz otomatik yıkama yapar. herhangi bir test, tekrar edilmek isteniyorsa TEKRAR komutu vermek yeterlidir. cihazdaki reaktif bölmesinin sıcaklığı önemlidir, bu yüzden bu bölmeler soğutuculudur. Genelde +4 derecedir. Fakat oda ısısı sıcaklığına sahip bölmeler de olabilir.

numune ve reaktif problarında seviye dedektörleri bulunmalı ve gerektiğinde herhangi bir serumu otomatik olarak seyreltebilmelidir. çok sayıda hasta sonucunu hafızasında saklayabilmeli ve her çeşit bilgisayara kolaylıkla bağlanabilmelidir.

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.4. flame fotometre (alev fotometresi): bir atomun elektronları, ısı etkisiyle uyarılabilirler. Bu şekilde daha üst bir enerji seviyesine ulaşmış elektronlar daha sonra eski enerji düzeylerine dönerlerken aradaki enerji farkını ışık olarak dışarı salarlar. Bu ışınlar her bir element için spesifiktir. Uygun bir dalga boyunda bu ışınların fotometrik ölçümü yapılırsa ortamdaki madde miktarıyla orantılı ışıma nedeniyle madde konsantrasyonu belirlenmiş olur. (ör, Na, K ölçümü)

1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.5. atomik absorbsiyon (AAS): temel prensibi alev fotometresinin tam tersidir. Burada element uyarılmaz, sadece kimyasal bağından ayrılır ve iyonlaşmamış nötral atom durumunda bulunur. Atomlar bu durumda 0,001-0,01 nm arası çok dar bantlı ışımayı absorbe edebilirler. Bu ışığın kaynağı katot lambasıdır. Flame fotometrede uyarılmış atomun saldığı ışın ölçülürken, AAS de atomun tuttuğu ışın ölçülür. (ör, bakır, çinko, demir ölçümü)

2- iyon selektif elektrotlar (ISE) Başta Na, K, Ca, Cl va Li olmak üzere pek çok elektrolitin (iyonun) tayininde geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu cihazlara iyon selektif analizörler denir. Burada, özel elektrotlar yardımı ile numunelerde potansiyel farkı ölçülür. Böylece numunelerdeki madde konsantrasyonu tayin edilir. Her bir element için ayrı bir elektrot vardır. Prensibi, iyon farkının bir membranda (zar) meydana getirdiği potansiyel farkın ölçülmesidir.

3- türbidimetri Deney ortamının bulanık olması durumunda, ışık kaynağından çıkan ışınların tamamı fotosele (dedektör) ulaşamaz. Fotosele ulaşan miktar, ortamın bulanıklığı ile ters orantılıdır. Bundan faydalanılarak bulanıklığa sebep olan madde konsantrasyonu hesaplanır. Bu metod genelde, numunedeki proteinlerin ölçümünde kullanılır. Proteinler denatüre edilerek bulanıklık oluşturulur. Bulanıklık, ortamdaki protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

4- nefelometri Türbidimetri gibi bulanıklığın ölçümü esasına dayanır. Fakat burada, ortamdaki partiküllerce, geliş eksenine göre 90° açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınların ölçülmesi söz konusudur. Türbidimetriden diğer farkı, partikül sayısı arttıkça türbidimetride % T azalırken, burada artar. %T: çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını gösterir (% transmittans).

Turbidimetride, Bulanıklık , % T (çözeltiye giren ışığın, çözeltiden çıkış yüzdesi) Nefelometride,

5- florometri Bir maddenin bir çözeltide çok küçük konsantrasyonlarda bile UV etkisi altında kuvvetli flüoresans verme özelliklerine dayanan miktar tayin yöntemidir.

6- düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümü Ortamdaki madde konsantrasyonu çok düşük olduğunda, yukarıda sayılan yöntemler kantitatif ölçüm için yetersiz kalır. Bu durumda, 6.1. enzim immunoassay 6.2. radyoimmunoassay (RIA) 6.3. kemilüminessans yöntemleri kullanılır.

6.1. enzim immunoassay: ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) EIA (enzyme immunoassay) EMIT (enzyme-multiplied immunassay technique) gibi isimleri vardır. Prensip: antijen-antikor arasındaki reaksiyona dayanır. İşaretli antijen ile işaretsiz antijen, antikorla reaksiyona girmek için yarışırlar. Tayin etmek istediğimiz işaretsiz antijendir. İşaretleyici madde olarak enzim kullanılır. Alkalen fosfataz en çok kullanılan enzimdir. Reaksiyon tamamlandıktan sonra ortama bir substrat eklenerek spektrofotometrik olarak enzim aktivitesi ölçülür.

6.2. radyoimmunassay (RIA) RIA, bağışıklık reaksiyonlarının spesifikliğini radyokimyasal yöntemlerle birleştiren bir analiz yöntemidir. Bu metodda işaretleyici olarak radyoaktif bir element kullanılır. En çok kullanılan I125’ dir. prensip: antijen-antikor ilişkisidir.

Antijen-antikor ilişkisi Örnek ile kaplı yüzey (antijenler) Nonspesifik proteinle doldurulmamış bölgelerin bloklanması Spesifik antijene karşı 1.cil antikorla inkübasyon Enzim bağlı antijen ile antikor kompleksi substrat Spesifik antijenin varlığını Gösteren renkli ürünün oluşumu

6.3. kemilüminessans Prensibi RIA’ya benzer. Ancak burada işaretleyici madde olarak radyoizotop yerine reaksiyona girdiğinde ışık yayan madde yani kemilüminesan madde kullanılır.

7- elektroforez Elektroforez, proteinlerin ve diğer elektriksel olarak yüklü moleküllerin, bir elektrik alanında göç etmelerine dayanan bir işlemdir.

7- elektroforez Bir molekülün göç hızı; molekülün net yüküne, molekülün büyüklüğüne, uygulanan voltajın yüksekliğine bağlıdır. Net yük, pozitif ve negatif yüklü birimlerin sayısına ve elektroforez tankının pH’sına bağlıdır. Fizyolojik pH’da çoğu proteinler anyondur; yani negatif yüklerin sayısı pozitif yüklerden fazladır. Bazı anyonlar; HCO3-, Cl-, HPO42-, SO42-, organik asitler, proteinler. Bazı katyonlar; Na+, K+, Ca2+, Mg2+

Elektroforez çeşitleri kağıt elektroforezi destek ortamı olarak filtre kağıdı kullanılır agaroz jel elektroforezi Destek ortamı, karbohidrat polimeri olan agaroz veya agaropektin selüloz asetat elektroforezi destek ortamı, selüloz asetat kağıtları poliakrilamid jel elektroforezi destek ortamı, poliakrilamid jel nişasta jel elektroforezi destek ortamı, nişasta immunoelektroforez jel üzerinde ayrılmış proteinler, antikorlarla etkileştirilir ve antijenik durumları hakkında bilgi edinilir kapiller elektroforez kapiller ve dedektör kullanılır

Kan plazması, neredeyse 100 farklı protein içerir Kan plazması, neredeyse 100 farklı protein içerir. Elektroforez sırasındaki davranışlarına göre, bunlar yaygın olarak beş farklı gruba bölünmüşlerdir. Bunlar: albumin α1-globulin α2-globulin β-globulin γ-globulin Albumin, kanın ozmotik basıncının korunmasında önemlidir. Ayrıca yağ asitleri, bilirubin, bazı steroid hormonlar, vitaminler ve Ca iyonları gibi lipofilik (yağsever) maddeler için taşıyıcı proteinlerdir.

Globulinler, lipidlerin, hormonların, vitaminlerin ve metal iyonlarının taşınmasında görev alır ve kan pıhtılaşma sisteminin önemli bir kısmını oluştururlar. Ayrıca bağışıklık sisteminin esas kısmını oluşturan antikorları (γ-globulinler) da içerirler.

Protein Grup Albumin α1-globulin α2-globulin β-globulin γ-globulin IgG, IgA, IgM, IgD, IgE γ-globulin Lipoprotein (LDL), transferrin, fibrinojen,transkobalamin, C-reaktif protein β-globulin Seruloplazmin, antitrombin III, haptoglobulin,kolinesteraz, plazminojen, vitamin D-bağlayıcı protein α2-globulin Antitripsin,antikimotripsin,lipoprotein(HDL), protrombin, transkortin, asit glikoprotein, tiroksin bağlayıcı globulin α1-globulin Albumin Protein Grup Plazma proteinleri

Plazma proteinlerinin elektroforezi: Albumin, % 52-58 α1-globulin, %2.4-4.4 α2-globulin, % 6.1-10.1 β-globulin, % 8.5-14.5 γ-globulin, % 10-21

8- kromotografi Başka yöntemlerle ayrılamayan aminoasitler, yağ asitleri, steroid hormonlar gibi maddeleri ayırmak için kullanılır. Ayrıca çeşitli ilaçların ve uyuşturucu maddelerin analizi amacıyla emniyet teşkilatında da kullanılır. Kromotografi ile ayrılan maddelerin çoğu renksizdir. Bu yüzden maddeleri birbirinden ayırdıktan sonra çeşitli boyalarla boyamak gerekir. Destek ortamı porlu yapıdadır. Ayrıca destek ortamı iki fazdan oluşur: Hareketli faz: maddelerin hareket etmesini (yürümesini) sağlayan akıcı faz Sabit faz: destek ortamı ile birlikte bulunan hareketsiz faz

Kromotografi çeşitleri: kolon kr. ince tabaka kr. gaz kr. HPLC (high performance liquid chromatography= yüksek perrformanslı sıvı kr.