GAZ KROMATOGRAFİSİ

Tanım:  Gaz kromotografisi de, öteki kromatografi dalları gibi bir karışımda bulunan maddeleri ayırmaya yarar. Hareketli ve sabit olmak üzere iki faz vardır ancak diğerlerinden farklı olarak hareketli fazın görevi sadece maddeleri taşımaktır. Yani diğer kromatografi dallarında olduğu gibi ayrılması istenen maddelerle hareketli faz arasında hiçbir etkileşme olmaz.  Sadece gazlar değil, düşük sıcaklıkta gaz haline dönüşebilen sıvı ve katı tüm maddelerin analizide bu metot ile yapılabilir.

 Yukarıdaki bilgilerden yola çıkarak GC’nin faydaları aşağıdaki gibi sıralanabilir:  1. Verilen bir numune içindeki uçucu maddelerin sayısının ve miktarının tayin edilmesi  2. Bir maddenin saf olup olmadığının araştırılması  3. Yeni geliştirilen bir metodun ne derece duyarlı olduğunun araştırılması

 Hareketli faz olarak kullanılan başlıca gazlar He, Ne, Ar, N 2 ve CO 2 ’dir.  Kolonların sabit fazı katı veya katı yüzeyine kaplanmış (katıya emdirilmiş) bir sıvı olabilir. Kullanılan kolon tiplerine göre gaz kromatografisi 2’ye ayrılır:  1. Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi (GSC)  2. Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (GLC)

1. Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi (GSC)  Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi prensip olarak zayıf adsorbsiyon prensibine dayanır. Sabit faz olarak silikajel, alümina (Al 2 O 3 ), aktif kömür gibi maddeler kullanılır.  Bu metotta elde edilen pikler kuyrukludur ve bu pikleri birbirinden ayırmak zor olduğu için genelde tercih edilmez. Kullanımı daha çok küçük moleküllü maddelerin ayrılmaları konusunda olur.

2. Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (GLC)  Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi en çok kullanılan metottur. Bu kromatografide kolon çapı mm olan kapiller kolonlar kullanılır. Bu kolonlarda gözenekli bir katı faz üzerine µm kalınlığında emdirilmiş büyük moleküllü özel bir sıvı faz bulunur. Sıvı-katı kromatografisine “açık tüplü kolon kromatografisi” de denir ve kolonlar 2’ye ayrılır:  A) Sabit fazı veya dolgu maddesi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (SCOT) (support-coated open tubuler columns)  B) İç yüzeyi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (WCOT) (wall coated open tubuler columns)

A) Sabit fazı veya dolgu maddesi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (SCOT): Dolgu maddesi veya destek maddesi olarak da adlandırılan gözenekli katı maddenin yüzeyi gözenekleri de dahil üniform olarak özel bir sıvıyla kaplanır.Hareketli olan basınçlı gaz (3 atm) fazı bu şekilde yüzeyi kaplanmış olan gözenekli katı parçacıklar arasından kolayca geçebilir. Dolgulu açık tüplü kolonlar, yüzeyi sıvıyla kaplanmış gözenekli bir dolgu maddesiyle doldurulmuş kolonlardır. Böyle maddeler genellikle diatome toprağından imal edilirler. Diatome toprağı kille karıştırılıp pişirilir. Pişirilen madde ezilir ve elenir. Elenen maddelerin µm çapında ve yuvarlak olmaları istenir. Bu şekilde hazırlanmış olan katı maddeler kromosorp P ve W veya Celite, Dicalite gibi adlar altında satılır. Bunlara destek maddeleri de denir. B) İç yüzeyi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (WCOT): Kolonun iç yüzeyi yaklaşık 30 µm kalınlığında bir sıvı film ile kaplanır. Yapılma ve kullanım kolaylığı vardır, ancak performans olarak SCOT kolonlar kadar iyi değillerdir. Açık tüplü kolonlar (WCOT), içleri boş olan kolonlardır. Kolonların iç yüzeyleri büyükçe moleküllü özel bir sıvı ile kaplanır. Bu kolonlar bakır, alüminyum, paslanmaz çelik ve camdan yapılmaktadır. Son yıllarda eritilmiş silikadan imal edilen kolonlar (FSOT kolonlar) piyasada bulunmaktadır.Bu kolonların iç çapları µm arasında değişmektedir.

1 A B AB A Zaman A+B+Gaz Şekil 1. Gaz kromatografisi A ve B gazlarının kolonda zamanla ayrılmaları

 Şekil 1:Bir karışımda A ve B maddeleri olsun. 1. A+B maddeleri sürükleyici bir gazla kolona girerler. 2. Zamana bağlı olarak pikleri birbirinden az çok ayrılır. 3. Pikler birbirinden iyice ayrılır ve B gazı dedektöre yaklaşır. 4. A gazı nerdeyse kolonu terkedip, dedektöre yaklaşır. Dedektör numunededeki gaz sayısı kadar pik verir. Dedektörden B sinyali önce, A sinyali ise sonra çıkar.

Gaz kromatografi cihazının kısımları:  GC 6 kısımdan oluşur: 1. Taşıyıcı gaz sistemi, silindir kısmı 2. Numune enjekte etme kısmı 3. Isıtma kısmı 4. Ayırma kolonu 5. Dedektör 6. Yazıcı

Taşıyıcı gaz sistemi, silindir kısmı: Taşıyıcı gaz olarak kimyaca inert helyum, argon, karbon dioksit, azot gibi gazlar kullanılır. Gaz kromatoğrafisinin kesinliği, kullanılan taşıyıcı, sürükleyici gazın akış hızının ve basıncının ayarlanmasına bağlıdır. Dakikada 150 ml’ye kadar gaz verilebilir ve cihazdaki gazın basıncı atm arasında değişir. Taşıyıcı gazın kuruluğu kolon performansına etki eden en önemli faktörlerdendir. Taşıyıcı gazda bulunan eser miktardaki su kolon sabit fazını giderek bozar. Oksijende kolon sabit fazını parçalayan en önemli faktörlerdendir. Bu nedenle polar bir kolonun ömrünü uzatmak için kolonu ısıtmadan önce kolondan 5 dakika süreyle taşıyıcı gaz geçirmek yararlıdır. Taşıyıcı gazı rutubetten ve kompresör pompasından gelebilecek hidrokarbonlardan temizlemek için bütün gaz hatlarına birer filtre takılmalıdır. Son olarak da gaz kaçağı olup olmadığı kontrol edilmelidir.

Numune enjekte etme kısmı ve Isıtma kısmı : Gaz kromatografisine örnek ya elle ya da otosampler dediğimiz parça mevcutsa otomatik olarak mikroşırıngalar yardımıyla silisli kauçuktan yapılmış bir tıpadan (septum) metal bir buharlaştırma hücresine (ısıtma kısmı) enjekte edilirler. Hücre sıcak olduğu için sıvı buharlaşır ve taşıyıcı gaz ile kolona sürüklenir. Hücre enjekte edilen örneğin kaynama noktasından 50 o C fazla olmalıdır. Enjekte edilen numune miktarı µl’dir. Gaz numuneler için bu miktar µl’dir. Katı numuneler ise ya gaz haline yada çözelti haline getirilip, alete enjekte edilir yada çok küçük ve ince cidarlı bir ampul vasıtasıyla cihaza yerleştirilir. Ampul dışarıdan yapılacak bir darbeyle numune yuvasında kırılır ve numune gaz akışıyla kolona, oradan da dedektöre sürüklenir.

 Dikkat edilecek hususlar:  Enjektör her seferinde septumu delerek geçtiği için septum zamanla aşınır ve gaz kaçırmaya başlar. Septum bu durumda yenilenmelidir.  Her enjeksiyonda kromatogram üzerinde sabit bir yerde görülen pik septumdaki degradasyona uğrayabilen maddelerden kaynaklanabilir. Bunlara ghost=hayalet pik denir. Bu durumda da degradasyona uğrayabilecek maddeler çeşitli işlemlerden geçirilerek septumdan uzaklaştırılmalıdır.  Her örnek enjeksiyonundan sonra enjektör uygun çözücü ile iyice temizlenmelidir.

Ayırma kolonu:  Daha öncede söylendiği gibi kolonlar;  A) Sabit fazı veya dolgu maddesi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (SCOT)  B) İç yüzeyi özel bir sıvı ile kaplanmış olan kolonlar (WCOT)olarak 2 çeşittir.  Kolon uzunlukları m arasında değişir. Başlıca yapıldığı maddeler:  1. Paslanmaz çelik  2. Saf bakır  3. Alimünyum  4. Teflon  5. Cam  6. Eritilmiş silica

  Kolonlar termostatlı bir hücreye yerleştirilir.   Bunun içinde kolonlar çapları cm arasında değişen kangallar haline getirilir.   Kolon sıcaklığı çok önemlidir. Kolon sıcaklığı ±0.1°C düzeyinde sabit tutulur. Bunu sağlamak içinde kolon termostatlı bir etüv içine yerleştirilir. Kolon sıcaklığı çalışılan numune ve istenen ayırma derecesine göre değişir. Genel olarak sıvı numunelerde, kaynama sıcaklığının az üstünde sabit tutulur. Bu şekilde kontrol altında tutulan numunelerde elüe edilme süresi 2-30 dakika arasındadır.   Kaynama aralığı geniş olan yani kaynama noktaları farklı birden fazla bileşeni içeren numunelerde, sıcaklık programlaması (Gradient, kademeli) yapılarak piklerin daha iyi ayrılıp belirgin hale gelmesi sağlanır.

 Başlangıç sıcaklığı numunede bulunan en düşük kaynama noktasına sahip bileşenin kaynama noktasının az üzerinde alınır. En yüksek sıcaklık ise örneğin bileşenlerine ve kolona zarar vermeyecek şekilde seçilmelidir.  ÖRNEK SICAKLIK PROĞRAMI (Gradient, kademeli): Başlangıçtaki fırın sıcaklığı 80 o C olup, 4 o C/dk oranında artışla 120 o C’ye, 10 o C/dk oranında artışla 120 o C’den 200 o C’ye artırılmış ve 30 dakika bu sıcaklıkta tutulmuştur.

Dedektörler ve Yazıcılar: Dedektörler ve Yazıcılar: GC’de kullanılacak olan bir dedektör, kolondan gelen taşıyıcı gaz içinde bulunan binde birkaç oranındaki maddeleri tespit edebilmelidir. Bir gazın pikinin dedektörden geçme zamanı bir saniye kadar olmalıdır. Dedektörde bulunması gereken özellikler: a) Analitlere geniş bir konsantrasyon aralığında aynı şekilde cevap verebilmeli b) Tekrarlanabilir sonuçlar vermeli c) Dayanıklı olmalı d) Oda sıcaklığından 500 o C’a kadar olan sıcaklıklarda çalışabilmeli e) Cevap verme zamanı çok kısa olmalı, akış hızından etkilenmemeli f) Kullanımı kolay, güvenirliği kesin olmalı g) Yeterli hassaslıkta olmalı

Gaz kromatografisinde kullanılan dedektör çeşitleri: 1. Termal iletkenlik dedektörü (TCD) 2.  -Işını dedektörleri 3. Alev iyonizasyon dedektörleri (FID) 4. Termiyonik dedektörler (TID) 5. Elektron yakalama dedektörleri (ECD) 6. Alev fotometrik dedektörler (FPD)

Termal iletkenlik Detektörleri: Çeşitli gazların ısıyı değişik oranlarda iletmesi esasına dayanır. Böyle dedektörlerde sabit bir akımla ısıtılmış volfram bir telden yararlanılır. β-ışını Detektörleri: Stronsiyum ve ya tritiyum kullanılır. Taşıyıcı argon gazı bu maddeler üzerinden geçirilerek uyarılır. Uyarılan argon atomları çarpışma sonucu yanında bulunan başka cinsten atomları iyonlaştırır. İyonlaşan atomların yükü özel bir düzenekle sinyallere çevrilir. İyonlaşan atomların sayısı ne kadar çoksa, sinyaller o kadar büyük olur.

Alev iyonizasyon detektörleri (FID): Kolondan gelen tür, birlikte hidrojen ve havayla karıştırılır. Bundan sonra hidrojenle ve hava karışımı elektrik kıvılcımı ile yakılır. Oluşan sıcaklıkta organik maddelerin büyük çoğunluğu iyon ve elektron verir. Böylece alev ortamı iletken hale gelir. Termiyonik Detektörler (TID) Alev iyonizasyon detektörlerinin yapısına benzer, kolondan çıkan gaz karışımı bir de hidrojenle karıştırılır ve ince uçlu bir bek alevine gönderilerek yakılır.

Elektron Yakalama Detektörleri (ECD) Kolondan çıkan gaz karışımı nikel-63 veya tritiyum gibi bir β-ışını yayıcısı üzerinden geçirilir. Bu esnada özellikle de azot ihtiva eden bileşiklerde büyük oranda iyonlaşma olur. Alev fotometrik Detektörleri (FPD) Özellikle hava ve suda pestisitlerin tespit ve tayinlerinde kullanılır.

Gaz kromatografisi ve Headspace aparatı:  Headspace direk numunenin kendisinin konulduğu bir otoörnekleyici (autosampler)’dir. GC cihazlarına bağlanacak şekilde imal edilmektedir (GC- Headspace).  *Numune katı yada çözelti halinde alete enjekte edilemiyorsa,  *bileşenler numunelerde az miktarda ve herhangi bir seperasyon veya ekstraksiyon aşaması ile ayrılıp elde edilemeyecekse numuneler direk headspace aparatının numune kabına yerleştirilir ve uygulanan yüksek sıcaklık ile bileşenler buharlaştırılır ve kolonda gaz yardımı ile dedektöre sürüklenerek ayrımları yapılır ve belirlenir. Örn: Direk peynir kullanılarak aroma maddelerinin belirlenmesi

 GAZ KROMATOGRAFİSİ TERİMLERİ: Alıkonma zamanı (t R ): Bir maddenin gaz kromatografisi cihazına enjekte edildikten sonra dedektörde sinyalinin (pikinin), görünmesine kadar geçen zamana denir. Alıkonma hacmi (V R ): Bir maddenin sinyalinin dedektörde meydana çıkmasına kadar harcanan taşıyıcı gazın hacmine, alıkonma hacmi denir. Alıkonma faktörü (R f ): Ayrımı yapılacak gazın kolon içindeki hızının, taşıyıcı gazın kolon içindeki hızına oranıdır.

GAZ KROMATOGRAFİSİNDE ÖRNEK HAZIRLAMA:  GC bilindiği gibi gaz veya gaz haline dönüştürülen maddelerin analizlerinde kullanılır.  Yağ asitleri, steroidler, bir çok ilaçlar, aminler, fenoller gibi polar bileşiklerin veya polifonksiyonel grupları kuyruklu pike sebep olan bileşiklerin çeşitli kimyasal maddelerle reaksiyona sokularak buharlaştırılabilir forma sokulması işlemine “türevlendirme” denir. Gaz kromatografide, polar fonksiyonlu grupların uygun reaktifler (özellikle aktif hidrojen atomları) ile türevlerinin alınması işlemi genellikle avantajlıdır.

 Türev oluşturmanın yararları:  Polar bileşiği daha az polar yapar  Kantitatif analizde dedektörün duyarlı olacağı bileşik elde edilir (daha düşük tanımlama limitlerini sağlar)  Yüksek molekül ağırlığına sahip bileşiklerin uçuculuğunu artırır  Separasyon etkinliğini düzeltir  Analizde daha az örnek ekstraktına ihtiyaç duyulur  Sıcaklığa dayanıklı bileşikler verir (daha iyi termal stabilite )

GAZ KROMATOGRAFİSİNDE KALİTATİF ANALİZ:  Kalitatif tayinlerde gaz kromatografisinde ayrılan maddelerin alıkonma zamanları ve alıkonma hacimlerinden yararlanarak, şüphelenilen bir maddenin numune de var olup olmadığı belirlenir. Metodun değerini artırmak için  -Şüphelenen bileşenin standardı ya alete enjekte edilerek alıkonma zamanı belirlenebilir yada  -kolondan çıkan fraksiyonlar MS, IR gibi cihazlare gönderilerek tanımlanabilir.

GAZ KROMATOGRAFİSİNDE KANTİTATİF ANALİZ:  Kantitatif analizler, analizi yapılacak maddenin belirlenecek bileşenine ait standardın farklı konsantrasyonlarda bir seri konsantrasyonu hazırlanıp, kromatografik metotlarla pik alanlarının ölçülmesi prensibine dayalı olarak yapılır.  Modern kromatografi cihazlarına elektronik integratör ilave edilmiştir ve böyle bir integratör pik alanını kolayca hesaplayıp gösterebilir.

 İşlem basamakları: 1. Örnekte belirlenecek olan A, B, C vb…. maddelerine ait standartların ayrı ayrı farklı konsantrasyonda çözeltileri (ppm) hazırlanır. 2. Her bir maddeye ait konsantrasyonlara ayrı ayrı kromatografik metot uygulanır ve pik alanları bulunur. 3. Grafik üzerinde x eksenine konsantrasyonlar, y eksenine ise pik alanı yerleştirilerek standartlara ait y=ax+b olan denklemler ve kalibrasyon grafikleri oluşturulur. 4. Aynı kromatografik metotla örneğimizin alıkonma zamanları ve pik alanları (y) belirlenir ve Her bileşene ait denklemde yerine konularak kantitatif hesaplamalar yapılır.